Syntese, Functionalization og karakterisering av Fusogenic porøse Silicon nanopartikler for Oligonucleotide levering
Summary
Viser vi syntese av fusogenic porøse silisium nanopartikler for effektiv i vitro og in vivo oligonucleotide levering. Porøse silisium nanopartikler er lastet med siRNA til kjernen, som er belagt med fusogenic lipider gjennom ekstrudering til skallet. Målretting moiety functionalization og partikkel karakteristikk er inkludert.
Abstract
Med ankomsten av genterapi, har utviklingen av en effektiv i vivo nukleotid-nyttelast levering system blitt legemidler. Fusogenic porøse silisium nanopartikler (F-pSiNPs) har nylig vist høy i vivo genet stanse effekt på grunn av sin høye oligonucleotide lasting kapasitet og unike mobilnettet opptak sti som unngår endocytose. Syntese av F-pSiNPs er en flertrinnsprosess som inkluderer: (1) lessing og tetting av oligonucleotide payloads i silisium porene; (2) samtidig belegg og dimensjonering av fusogenic lipider rundt porøse silisium kjernene; og (3) Bøyning av målretting peptider og vaske for å fjerne overflødig oligonucleotide, silisium rusk og peptid. Partikkelens størrelse ensartethet er preget av dynamisk lysspredning og kjerne-shell strukturen kan verifiseres ved overføring elektronmikroskop. Fusogenic opptak valideres av lessing en lipofile fargestoff, 1, 1-dioctadecyl-3,3, 3′, 3-tetramethylindocarbocyanine-perklorat (DiI), i fusogenic lipid bilayer og behandler det til celler i vitro å observere for plasma membran flekker endocytic steder. Målretting og in vivo genet stanse efficacies tidligere kvantifisert i en musemodell av Staphylococcus aureus lungebetennelse, der målretting peptid forventes å F-pSiNPs hjem til området av smitte. Utover sin søknad i S. aureus infeksjoner, kan F-pSiNP systemet brukes til å levere noen oligonucleotide for genterapi av en rekke sykdommer, inkludert virusinfeksjoner, kreft og autoimmune sykdommer.
Introduction
Genterapi modulerer bestemt genuttrykk for å få en terapeutisk utfall. Mange verktøy for genet moduleringshjul har blitt oppdaget og studert, inkludert ribonukleinsyre forstyrrelser (RNAi) med oligonucleotides (f.eks kort forstyrrende RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4 ), DNA plasmider5,6, nucleases (f.eks sink finger, TALENS)7,8, og CRISPR/Cas9 systemer9,10. Mens hvert verktøy virkningsmekanismen er forskjellig, må alle verktøy nå i cellen cytoplasma eller kjernen å være aktiv. Som sådan, mens disse verktøyene har bevist for å forårsake betydelig effekt i modulerende genuttrykk i vitro, lider i vivo effekten av ekstracellulære og intracellulær hindringer. På grunn av at verktøyene er biologisk opprinnelse, finnes mange enzymer og klaring systemer i kroppen som kan redusere eller fjerne den fremmede molekyler11. Også i tilfelle lider at verktøyene nå målcelle, de av endocytose; en modus av mobilnettet opptak som omslutter og feller verktøyene i Sure mage som blemmer som fornedre eller utvise verktøyene av cellen. Faktisk har studier vist at lipid nanopartikler er endocytosed via macropinocytosis, som er ca 70% av siRNA exocytosed fra cellene innen 24 timer opptak12,13. Fleste av de gjenværende siRNA er degradert gjennom lysosomale sti, og til slutt bare 1-2% av siRNA som opprinnelig kommer inn i cellen med nanopartikler oppnå endosomal flykte til potensielt gjennomgå RNAi13,14 .
Vi har nylig utviklet fusogenic porøse silisium nanopartikler (F-pSiNPs) som har en siRNA-lastet core består av porøse silisium nanopartikler og en fusogenic lipid shell15. F-pSiNPs presenterer tre store fordeler over andre konvensjonelle oligonucleotide leveringssystemer: (1) en fusogenic lipid belegg som gjør at partiklene til å omgå endocytose og levere hele nyttelast direkte i cellen cytoplasma (i motsetning til 1-2% oppnådd ved endocytosed partikler13,14) (figur 1). (2) høy masse lasting av siRNA i pSiNPs (> 20 wt % i forhold til 1-15 wt % av konvensjonelle systemer)15, raskt redusere i cytoplasma (når kjernen partikler kaster lipid belegget via fusogenic opptak) for å løslate siRNA; og (3) målretting peptid Bøyning for selektiv homing til ønsket celletyper i vivo.
F-pSiNP systemet har vist betydelig genet stanse effekten (> 95% i vitro; > 80% i vivo) og påfølgende terapeutisk effekt i en alvorlig musemodell for S. aureus lungebetennelse; resultatene som ble utgitt tidligere15. Av kompliserte strukturer av F-pSiNP systemet krever imidlertid førsteklasses fingerfølsomhet og finjustert optimalisering generere enhetlig og stabil nanopartikler. Dermed er formålet med dette arbeidet å presentere en grundig protokoll, samt optimalisering strategier for syntese, functionalization og karakterisering av F-pSiNPs som skal brukes i målrettede levering av siRNAs for potente genet stanse effekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syntese av porøse silisium nanopartikler er vist i figur 5. Det kritiske trinnet syntese av fusogenic pSiNPs er i lasting trinn (trinn 3). Hvis fusogenic nanopartikler samler etter syntese (Figur 3), årsaken kan skyldes følgende: (1) veisalt lager var ikke homogenously forberedt, dermed trinn 3.1.2 må være nøye fulgt eller raffinert; eller (2) forholdet mellom pSiNP: siRNA: CaCl2 eller konsentrasjonen av en eller flere av de tre komponentene kan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health gjennom kontrakt # R01 AI132413-01.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | Powder |
| 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt) (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890P | Powder |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG(2000) Maleimide) | Avanti Polar Lipids | 880126P | Powder |
| Aluminum foil | VWR International, LLC | 12175-001 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Spectrum | C1977 | Anhydrous, Pellets |
| Chloroform | Fisher Scientific | C6061 | |
| Computer | Dell | Dimension 9200 | Any computer with PCI card slot is acceptable |
| Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | Life Technologies | D3911 | |
| Ethanol (EtOH) | UCSD Store | 111 | 200 Proof |
| Hydrofluric acid (HF) | VWR International, LLC | MK264008 | Purity: 48% |
| Keithley 2651a Sourcemeter | Keithley | 2651A | |
| LabVIEW | National Instruments | Sample program available at: http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| Liposome extrusion set with heating block | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Microcon-30kDa Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | MRCF0R030 | |
| O-ring | ChemGlass | CG-305-220 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | |
| Platinum coil | VWR International, LLC | AA10285-BU | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-3 | |
| Silicon wafer | Siltronix | Custom order | |
| siRNA | Dharmacon | Custom order | IRF5, sense 5’-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3’ and antisense 5’-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3’ |
| Sonicator | VWR International, LLC | 97043-960 | |
| Targeting peptide (CRV) | CPC Scientific | Custom order | sequence CRVLRSGSC; made cyclic by a disulfide bond between the side chains of the two cysteine residues |
| Teflon etch cell | Interface Performance Materials, Inc. | Custom order | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 |
References
- Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5 (2004).
- Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151 (2017).
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104 (2011).
- Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
- Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
- Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
- Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738 (2017).
- Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1, (2012).
- Dai, W. -. J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 5, e349 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
- Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969 (2018).
- Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub> Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
- Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613 (2018).
- Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145 (2016).
