En ikke-tilfældig muse model for farmakologisk reaktivering af Mecp2 på inaktiv X-kromosom
Summary
Her beskriver vi en protokol til at generere en levedygtig kvindelig murine model med ikke-tilfældige X kromosom inaktivering, dvs., det maternally-nedarvede X-kromosom er inaktiv i 100% af cellerne. Vi beskriver også en protokol til afprøvning af gennemførlighed, tolerabilitet og sikkerhed ved farmakologisk reaktivering af det inaktive X-kromosom in vivo.
Abstract
X kromosom inaktivering (XCI) er den tilfældige hæmning af et X kromosom hos kvinder for at opnå gendose ring balance mellem kønnene. Som et resultat, alle kvinder er heterozygot for X-linked genekspression. En af de vigtigste regulatorer af XCI er Xist, som er afgørende for initiering og vedligeholdelse af XCI. Tidligere undersøgelser har identificeret 13 Trans Acting X kromosom inaktiverings faktorer (Xcif’er) ved hjælp af en storstilet, tab-af-funktion genetisk skærm. Hæmning af Xcif’er, såsom ACVR1 og PDPK1, ved hjælp af kort Hårnåle RNA eller små molekyler hæmmere, genaktiverer X kromosom-sammenkædede gener i dyrkede celler. Men gennemførligheden og tolerabiliteten af reaktivering af det inaktive X-kromosom in vivo er endnu ikke fastlagt. Mod dette mål, en Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodel er blevet genereret med ikke-tilfældige XCI på grund af sletning af Xist på en X kromosom. Ved hjælp af denne model var omfanget af inaktiv X-reaktivering kvantiteret i muse hjernen efter behandling med XCIF-hæmmere. Nyligt offentliggjorte resultater viser for første gang, at farmakologisk hæmning af XCIFs genaktiverer Mecp2 fra det inaktive X-kromosom i kortikale neuroner i den levende musehjerne.
Introduction
X kromosom inaktivering (XCI) er en proces af dosering kompensation, der balancerer X-linked genekspression ved at genhæmning en kopi af X-kromosomet hos kvinder1. Som følge heraf akkumulerer det inaktive X-kromosom (XI) karakteristiske træk ved heterokromatin, herunder DNA-methylering og hæmmende histonmodifikationer, såsom Histon H3-lysin 27 trimethylering (H3K27me3) og Histon H2A ubiquitination (H2Aub) 2. den overordnede regulator af x-kromosom hæmning er x-inaktiverings Center (xic)-regionen, ca. 100 − 500 kb, som styrer optællingen og parringen af x-kromosomerne, det tilfældige valg af x-kromosom til inaktivering og initiering og spredning af genhæmning langs X-kromosomet3. Processen med X inaktivering initieres af X inaktiv specifik afskrift (Xist), der frakker XI i CIS til at mægle kromosom-dækkende lyddæmpnings-og omforme den tredimensionale struktur af x-kromosom4. For nylig har flere protemiske og genetiske skærme identificeret yderligere regulatorer af XCI, såsom xist interagerende proteiner5,6,7,8,9 , 10 stk. , 11 af , 12. for eksempel, en tidligere undersøgelse ved hjælp af en upartisk genom-dækkende RNA interferens skærm identificeret 13 Trans-virkende XCI faktorer (xcifs)12. Mekanisk, XCIFs regulerer Xist udtryk og derfor interfererer med xcifs funktion forårsager defekt XCI12. Sammen har de seneste fremskridt på området givet vigtig indsigt i de molekylære maskiner, der er nødvendige for at initiere og vedligeholde XCI.
Identifikation af XCI regulatorer og forståelse af deres mekanisme i XCI er direkte relevant for X-linked humane sygdomme, såsom RETT syndrom (RTT)13,14. RTT er en sjælden Neuro udviklende lidelse forårsaget af en heterozygot mutation i det X-linkede methyl-CpG-bindingsprotein 2 (MECP2), der påvirker overvejende piger15. Da MECP2 er placeret på X-kromosomet, er RTT-pigerne heterozygot for MECP2 mangel med ~ 50% celler, der udtrykker vildtype og ~ 50% udtrykker mutant MECP2. Især RTT mutant celler havn en sovende, men vild-type kopi af Mecp2 på XI, der giver en kilde til det funktionelle gen, som hvis reaktiveret, kunne potentielt lindre symptomer på sygdommen. Ud over RTT, der er flere andre X-linked menneskelige sygdomme, for hvilke reaktivering af XI repræsenterer en potentiel terapeutisk tilgang, såsom DDX3X syndrom.
Hæmning af XCIFs, 3-phosphoinositide afhængige protein kinase-1 (PDPK1) og Activity A receptor type 1 (ACVR1), enten ved kort hårnål RNA (shRNA) eller små Molekylær hæmmere, genaktiverer XI-sammenkædede gener12. Farmakologisk reaktivering af XI-linkede gener observeres i forskellige ex vivo modeller, der omfatter muse fibroblast cellelinjer, voksne mus kortikale neuroner, mus embryonale fibroblaster, og fibroblast cellelinjer afledt af en RTT patient12. Det er dog endnu ikke påvist, om farmakologisk reaktivering af XI-linkede gener er gennemførlig in vivo. En begrænsende faktor er manglen på effektive dyremodeller til nøjagtigt at måle ekspressionen af gener fra genaktiveret XI. Mod dette mål, en Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodel er blevet genereret, der bærer en genetisk mærket Mecp2 på XI i alle cellerne på grund af heterozygot sletning i Xist på maternel X kromosom16. Ved hjælp af denne model, er udtrykket af Mecp2 fra XI blevet kvantiteret efter behandling med XCIFs hæmmere i hjernen af levende mus. Her er den generation af xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp musemodel og metodologi til kvantitat XI reaktivering i kortikale neuroner ved hjælp af immunofluorescens-baserede analyser beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere blev Xcif’er, der selektivt kræves til hæmning af XI-linkede gener i pattedyrs kvindelige celler, identificeret12. Vi yderligere optimeret potente små molekyle hæmmere til at målrette XCIFs, såsom ACVR1 og downstream effektorer af PDPK1, som effektivt genaktivere XI-linked Mecp2 i mus fibroblast cellelinjer, mus kortikale neuroner, og en menneskelig fibroblast celle afledt af en RTT-patient. Disse resultater tyder på, at XI reaktivering er en plausibel terapeutisk tilgang…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Antonio Bedalov for at levere reagenser; University of Virginia vævs histologi kerne til kryosektionering; University of Virginia flow flowcytometri Core for flow cytometri analyse; Christian Blue og Saloni Singh for teknisk assistance med genotypebestemmelse. Dette arbejde blev støttet af en dobbelt hoo Research Grant til Z.Z., og en pilot Project program Award fra University of Virginia-Virginia Tech Seed fund Award og Hartwell Foundation individuelle biomedicinsk forskning Award til S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
References
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
