Улучшение прививки человека индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных кардиомиоцитов через переходный ингибирование Деятельности Ро Киназы
Summary
В этом протоколе мы демонстрируем и подробно о том, как использовать искусственные плюрипотентные стволовые клетки человека для диффериоцитной дифференциации и очистки, и далее, о том, как улучшить его эффективность трансплантации с ингибитором родо-синазы, связанных с Ро-ассоциированным предварительной обработки в модели инфаркта миокарда мыши.
Abstract
Решающим фактором в повышении эффективности клеточной терапии для регенерации миокарда является безопасное и эффективное увеличение скорости прививок клеток. Y-27632 является очень мощным ингибитором Rho-связанных, скручивания,содержащих белок киназы (RhoA/ ROCK) и используется для предотвращения диссоциации индуцированной клеточной апоптозы (anoikis). Мы демонстрируем, что Y-27632 предлечения для человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (hiPSC-CMsЗРИ) до имплантации приводит к улучшению скорости клеток при в мышиной модели острого инфаркта миокарда (MI). Здесь мы описываем полную процедуру дифференциации hiPSC-CMs, очищения и клеточной предобработки с помощью Y-27632, а также результирующее сокращение клеток, временные измерения кальция и трансплантацию в мышиные модели MI. Предлагаемый метод обеспечивает простой, безопасный, эффективный и недорогой метод, который значительно увеличивает скорость прививок клеток. Этот метод не может быть использован только в сочетании с другими методами для дальнейшего повышения эффективности трансплантации клеток, но и обеспечивает благоприятную основу для изучения механизмов других сердечных заболеваний.
Introduction
Стволовые клетки на основе терапии показали значительный потенциал в качестве лечения сердечного повреждения, вызванного MI1. Использование дифференцированных HIPSCs обеспечивает неисчерпаемый источник hiPSC-CMs2 и открывает двери для быстрого развития прорыв лечения. Тем не менее, многие ограничения на терапевтический перевод остаются, в том числе проблема сильно низкой скорости прививок имплантированных клеток.
Диссоциирующая клетка с трипсином инициирует anoikis3, который только ускоряется, как только эти клетки вводят сявок в суровые среды, такие как ишемический миокард, где гипоксическая среда ускоряет курс к смерти клеток. Из оставшихся клеток значительная часть вымывается из места имплантации в кровоток и распространяется по всей периферии. Одним из ключевых апоптотических путей является путьRhoA/ROCK 4. Основываясь на предыдущих исследованиях, RhoA / ROCK путь регулирует актина цитоскелетной организации5,6, который отвечает за дисфункцию клеток7,8. Ингибитор ROCK Y-27632 широко используется при соматической и стволовой клетке диссоциации и прохода, чтобы увеличить слипания клеток и уменьшить апоптоз клеток9,10,11. В этом исследовании, Y-27632 используется для лечения hiPSC-CMs до трансплантации в попытке увеличить скорость прививования клеток.
Было установлено несколько методов, направленных на улучшение скорости прививок клеток, таких как тепловой шок и мембранное матримальное покрытие подвала12. Помимо этих методов, генетические технологии могут также способствовать пролиферации кардиомиоцитов13 или обратить вспять немиокардиальные клетки в кардиомиоциты14. С точки зрения биоинженерии, кардиомиоциты посеяны на биоматериал эшафот для повышения эффективности трансплантации15. К сожалению, большинство из этих методов являются сложными и дорогостоящими. Напротив, предложенный здесь метод прост, экономичен и эффективен, и его можно использовать как базальное лечение до трансплантации, так и в спряжении с другими технологиями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключевыми шагами этого исследования являются получение чистого hiPSC-CMs, повышение активности hiPSC-CMs через предварительное лечение Y-27632 и, наконец, пересадка точного количества hiPSC-CMs в модель мыши MI.
Ключевые вопросы, которые были рассмотрены здесь, были в том, что, во-первых, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят д-ра Джозефа К. Ву (Стэнфордский университет) за любезное предоставление конструкции Fluc-GFP и д-ра Янвена Лю за отличную техническую помощь. Это исследование поддерживается Национальными институтами здравоохранения RO1 грантов HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (до J. З.), и HL121206A1 (в Л.З.), и R56 грант 16SDG30410018, и Университет Алабамы в Бирмингеме факультета развития Грант (до В.З.).
Materials
| Reagent | |||
| Accutase (stem cell detachment solution) | STEMCELL Technologies | #07920 | |
| B27 minus insulin | Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | |
| CHIR99021 | Stem Cell Technologies | 72054 | |
| DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red | Thermofisher | 20163029 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Fluo-4 AM (calcium indicator) | Invitrogen/Thermofisher | F14201 | |
| Glucose-free RPMI 1640 | Fisher Scientific | 11879020 | |
| IWR1 | Stem Cell Technologies | 72562 | |
| Matrigel (extracellular matrix ) | Fisher Scientific | CB-40230C | |
| mTeSR (human pluripotent stem cells medium) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Pen-strep antibiotic | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Pluronic F-127 (surfactant polyol) | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| Rho activator II | Cytoskeleton | CN03 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875119 | |
| Sodium DL-lactate | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| TrypLE (cell-dissociation enzymes) | Fisher Scientific | 12-605-010 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and Supplies | |||
| IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments | PerkinElmer | CLS136334 | |
| 15 mm Coverslips | Warner | CS-15R15 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Confocal Microscope | Olympus | IX81 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | NX50 | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Electrophoresis Power Supply | BIO-RAD | 1645050 | |
| Fluoresence Microscope | Olympus | IX83 | |
| High Speed Camera | pco | 1200 s | |
| Laser Scan Head | Olympus | FV-1000 | |
| Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system) | Warner Instruments | RC-42LP | |
| Microincubation System | Warner Instruments | DH-40iL | |
| Minivent Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 845 | |
| NOD/SCID mice | Jackson Laboratory | 001303 | |
| Precast Protein Gels | BIO-RAD | 4561033 | |
| PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | |
| Trans-Blot System | BIO-RAD | Trans-Blot Turbo | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab198580 | |
| Cardiac Troponin T | R&D Systems | MAB1874 | |
| Cardiac Troponin C | Abcam | ab137130 | |
| Cardiac Troponin I | Abcam | ab47003 | |
| Cy5-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-175-150 | |
| Cy3-donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-165-152 | |
| Fitc-donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 715-095-150 | |
| GAPDH | Abcam | ab22555 | |
| Human Cardiac Troponin T | Abcam | ab91605 | |
| Integrin β1 | Abcam | ab24693 | |
| Ki67 | EMD Millipore | ab9260 | |
| N-cadherin | Abcam | ab18203 | |
| Phospho-Myosin Light Chain 2 | Cell Signaling Technology | 3671s | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Matlab | MathWorks | R2016A | |
| Image J | NIH | 1.52g |
References
- Menasche, P., et al. Towards a clinical use of human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors: a translational experience. European Heart Journal. 36 (12), 743-750 (2015).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Frisch, S. M., Francis, H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis. Journal of Cell Biology. 124 (4), 619-626 (1994).
- Haun, F., et al. Identification of a novel anoikis signalling pathway using the fungal virulence factor gliotoxin. Nature Communications. 9 (1), 3524 (2018).
- Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
- Katoh, K., Kano, Y., Noda, Y. Rho-associated kinase-dependent contraction of stress fibres and the organization of focal adhesions. Journal of The Royal Society Interface. 8 (56), 305-311 (2011).
- Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression. Biochimica et Biophysica Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).
- Legate, K. R., Fassler, R. Mechanisms that regulate adaptor binding to beta-integrin cytoplasmic tails. Journal of Cell Science. 122 (Pt 2), 187-198 (2009).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS One. 5 (8), e12148 (2010).
- Ni, Y., Qin, Y., Fang, Z., Zhang, Z. ROCK Inhibitor Y-27632 Promotes Human Retinal Pigment Epithelium Survival by Altering Cellular Biomechanical Properties. Current Molecular Medicine. 17 (9), 637-646 (2017).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature Biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
- Zhu, W., Zhao, M., Mattapally, S., Chen, S., Zhang, J. CCND2 Overexpression Enhances the Regenerative Potency of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Remuscularization of Injured Ventricle. Circulation Research. 122 (1), 88-96 (2018).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
- Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Ong, S. G., et al. Microfluidic Single-Cell Analysis of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes After Acute Myocardial Infarction. Circulation. 132 (8), 762-771 (2015).
- Zhao, M., et al. Y-27632 Preconditioning Enhances Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Myocardial Infarction Mice. Cardiovascular Research. , (2018).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
- Silginer, M., Weller, M., Ziegler, U., Roth, P. Integrin inhibition promotes atypical anoikis in glioma cells. Cell Death & Disease. 5, e1012 (2014).
- Lelievre, E. C., et al. N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation. PLoS One. 7 (3), e33206 (2012).
- Murata, K., et al. Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells. Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).
- Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).
