इस अनुच्छेद में, हम मॉडल माइकोबैक्टीरियम, माइकोबैक्टीरियम स्मेगमेटिसमें स्थानांतरीय त्रुटि और गलत तरीके से होने वाली विशिष्ट दरों को मापने के लिए दो पूरक विधियां प्रस्तुत करते हैं, जो लाभ के फंक्शन रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करते हैं । विधियों में एक अधिक उच्च-थ्रूपुट सेटिंग में कम थ्रूपुट या सापेक्ष त्रुटि दरों में सही त्रुटि दरों को मापने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
जीन का प्रोटीन में अनुवाद करने से त्रुटियों का खतरा रहता है । यद्यपि मॉडल प्रणालियों में स्थानांतरीय त्रुटि की औसत दर एक codon प्रति 10000 होने का अनुमान है, वास्तविक त्रुटि दरों में व्यापक रूप से भिंन, प्रजातियों पर निर्भर करता है, पर्यावरण, और codon अध्ययन किया जा रहा है । हम पहले से पता चला है कि आइसोलेटों aminoacylated glutamine और ऐस्पेराजीन trnas की पीढ़ी के लिए एक दो कदम मार्ग का उपयोग करें और यह विशेष रूप से अपेक्षाकृत उच्च त्रुटि गलत ranslation दरों के मॉडुलन के कारण दरों के साथ जुड़ा हुआ है एक मार्ग के आवश्यक घटक, amidotransferase GatCAB । हम पहले से कार्यरत renilla-जुगनू दोहरी-luciferase प्रणाली है कि ग्लूटामेट पर ग्लूटामेट के विशिष्ट गलत ढंग से स्पष्ट करना दरों को मापने के लिए mycoichia कोलाई में mistranslation दरों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि संशोधित aspartate codons के लिए codons और aspartate । हालांकि इस रिपोर्टर प्रणाली विशिष्ट त्रुटि दरों के सटीक अनुमान के लिए उपयुक्त था, संवेदनशीलता की कमी और अत्यधिक हेरफेर कदम के लिए आवश्यकताओं इसे उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए अनुपयुक्त बना दिया । इसलिए, हम एक दूसरे लाभ के-समारोह रिपोर्टर प्रणाली विकसित की, Nluc luciferase और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग (GFP), जो अधिक मध्यम/ हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया kasugamycin एक छोटे अणु है कि माइकोबैक्टीरियल mistranslation कम कर सकते है के रूप में पहचान । हालांकि संवाददाताओं कि हम यहां का वर्णन करने के लिए माइकोबैक्टीरियल mistranslation के विशिष्ट प्रकार के उपाय इस्तेमाल किया गया है, वे मॉडल सिस्टम के एक नंबर में mistranslation के अंय प्रकार के उपाय को संशोधित किया जा सकता है ।
आण्विक जीवविज्ञान में सूचना के प्रवाह के लिए कार्यात्मक प्रोटीन के लिए आनुवंशिक जानकारी के अनुवाद की आवश्यकता है । सभी जैविक प्रणालियों के साथ के रूप में, जीन अनुवाद भी मापने योग्य त्रुटियों शामिल है । अनुवाद में त्रुटि की दरों का अनुमान आम तौर पर लगभग 1/10000 प्रति कोडोन के रूप में उद्धृत कर रहे है (ribas डी pouplana एट अल.1द्वारा समीक्षित) । हालांकि, त्रुटि दरों में व्यापक रूप से, से कम 10-5 से अधिक 0.05/codon1,2,3,4,5से भिंन है । त्रुटि दरों की एक विस्तृत श्रृंखला, परिमाण के तीन से अधिक आदेश फैले, तथ्य यह है कि त्रुटियों अनुवाद मार्ग में कई चरणों से उत्पंन कर सकते है की वजह से है: stochastic, उत्कलनात्मक, या तनाव-aminoacylation में त्रुटियों प्रेरित6, 7 । , 8 । , 9 , 10, asparaginyl के शारीरिक misacylation-और ग्लूटामिनिल-trnas5, या राइबोसोमल डिकोडिंग त्रुटियों2,3,11. Measurably उच्च त्रुटि दरों, पर प्रतिनिधित्व 0.01/codon, सुझाव दिया है कि ट्रांसलेशनल त्रुटियों शारीरिक कार्य कर सकते हैं1,12 और गलत तरीके से किया जा सकता है कि संदर्भ-विशिष्ट13.
हमने और दूसरों ने दिखाया है कि स्वाभाविक रूप से जीन अनुवाद में होने वाली त्रुटियों अनुकूली हो सकता है, विशेष रूप से पर्यावरण तनाव के दौरान1,5,12,14,15,16 ,17,18. माइकोबैक्टेरिया में दो-कदम अप्रत्यक्ष ग्लूटेमीन/asparagine trna aminoacylation मार्ग19,20 द्वारा उत्पन्न त्रुटियों में पहली पंक्ति एंटीट्यूबरक्लोसिस एंटीबायोटिक रिफैम्पिसिन के लिए एक उल्लेखनीय वृद्धि सहिष्णुता में परिणाम 5. इसलिए, हम speculated है कि कम करने के लिए एक छोटे अणु के साथ माइकोबैक्टीरियल धुंध rifampicin द्वारा हत्या की संभावना हो सकती है । हम के लिए जांच की और एक यौगिक है कि माइकोबैक्टीरियल mistranslation कम हो सकता है के रूप में स्वाभाविक रूप से होने वाली aminoglycoside kasugamycin की पहचान की, विट्रो में दोनों और वीवो21में माइकोबैक्टीरियल की मध्यस्थता rifampicin की हत्या, और सीमा रिफेम्पिसिन प्रतिरोध21का उद्भव, जो तपेदिक के वैश्विक नियंत्रण22 -दुनिया के सबसे घातक रोगज़नक़ के लिए खतरा है ।
स्थानांतरीय त्रुटि का अध्ययन करने के लिए, गलत तरीके से माप के लिए तरीकों को नियोजित किया जाना है । वहां कई तरीकों कि mistranslation के माप के लिए विकसित किया गया है, फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक रहे हैं । संक्षेप में, प्रेसिजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित विधियों के कई फायदे हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि स्थानांतरीय त्रुटि के कई प्रकारों का पता लगाने के लिए नए एल्गोरिदम के साथ, गलत तरीके से निष्पक्ष माप का एक अपेक्षाकृत निष्पक्ष मापन किया जा सकता है 18प्रदर्शन किया । हालांकि, मास स्पेक्ट्रोमेट्री गलत तरीके से deamidation की घटनाओं के मापन के लिए उपयुक्त नहीं है-ठीक प्रकार से गलत तरीके से उत्पन्न होने वाले माइक्रोबैक्टीरिया में त्रुटि-प्रवण अप्रत्यक्ष tRNA aminoacylation मार्ग के कारण. यह एक अत्यंत उच्च पृष्ठभूमि संकेत में जिसके परिणामस्वरूप, मास स्पेक्ट्रोमेट्री23के लिए नमूनों की प्रोसेसिंग में होता है कि उच्च आवृत्ति nonenzymatic deamidation के कारण है । इसलिए, इस मार्ग में त्रुटियों का पता लगाने के लिए, आनुवंशिक लाभ के समारोह पत्रकारों के विशिष्ट लाभ प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, उपयुक्त लाभ के समारोह पत्रकारों बहुत कम पृष्ठभूमि दर हो सकता है, बहुत कम त्रुटि दर11की माप की अनुमति ।
रोगजनक माइकोबैक्टीरियम तपेदिक के साथ प्रयोग करने के बाद से विशेष सुविधाओं और अतिरिक्त सावधानियों की आवश्यकता है, हम nonpathogenic माइकोबैक्टीरियम एम में सबसे अधिक प्रयोग प्रदर्शन करते हैं – और पहले से पता चला है कि दोनों प्रजातियों के बीच परिणाम मोटे तौर पर तुलनीय5,21हैं । अप्रत्यक्ष tRNA aminoacylation मार्ग द्वारा उत्पन्न माइकोबैक्टेरिया में गलत ranslation दरों को मापने के लिए, हम एक Renilla-जुगनू दोहरी-luciferase प्रणाली है कि पहले ई. कोली में राइबोसोमल डिकोडिंग त्रुटियों को मापने के लिए विकसित किया गया था संशोधित 11 माइक्रोबैक्टीरिया में इस्तेमाल के लिए । हम तीन विशिष्ट संशोधनों किया: मूल रिपोर्टर कुशलतापूर्वक मायकोबैक्टीरिया में व्यक्त नहीं किया, और इसलिए, अनुक्रम codon-अनुकूलित किया गया था, और सी टर्मिनल तीन जुगनू luciferase के अमीनो एसिड, serine-lysine-leucine, जो किया गया है कुछ24प्रणालियों में एक अवैध व्यापार के संकेत के रूप में एनोटेटिड, आइसोयूसीन-alanine-valine25के लिए संशोधित किया गया था । मूल संवाददाता जुगनू luciferase mutated में एक महत्वपूर्ण lysine अवशेष था । इसके बजाय, हम या तो एक गंभीर रूप से संरक्षित aspartate (D120) या ग्लूटामेट (E144) अवशेष के renilla luciferase में aspartate और ग्लूटेमीन, क्रमशः25 (चित्रा 1) उत्परिवर्तित । रिपोर्टर को एपिसोमल टेट्रासाइक्लिन-इंदूसिबल प्लाज्मिड प्यूव-टेटोर ( सामग्रियों की तालिकादेखें) में विभाजित किया गया था । लाभ के समारोह पत्रकारों को गंभीर रूप से रूपांतरित करना एंजाइमों में कार्यात्मक अवशेष/फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि उंहें nonfunctional11,26renders । स्थानांतरीय (या सैद्धांतिक रूप से, ट्रांस्क्रिप्शनल) त्रुटियों कि प्रोटीन के कार्यात्मक संस्करण synthesize अनुवाद प्रोटीन का एक सबसेट में मापने योग्य एंजाइम गतिविधि में परिणाम होगा । प्रोटीन बहुतायत में भिन्नता के लिए सही करने के लिए, उत्परिवर्तित रिपोर्टर एक कार्यात्मक प्रोटीन के साथ एक बेंचमार्क के रूप में कार्य करता है और लाभ के समारोह11की सटीक मात्रा के लिए अनुमति देता है coexpressed है । Whilst renilla-जुगनू दोहरी-luciferase रिपोर्टर विशिष्ट माइकोबैक्टीरियल mistranslation दरों की सही माप के लिए अनुमति दी5,25 (चित्रा 2 और प्रोटोकॉल की धारा 1), हम जल्दी से यह महसूस किया कि यह अणुओं की मध्यम/उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त नहीं है जो कि गलत तरीके से होने वाली दर को बदल देगा । यह मुख्य रूप से दो कारणों के लिए कारण है, अर्थात्, एक) Renilla luciferase की शक्ति की सापेक्ष कमी का मतलब है कि एक ंयूनतम के 1 मिलीलीटर माइकोबैक्टीरियल संस्कृति/ एंजाइम गतिविधि मापन के लिए अत्यधिक मैनुअल हैंडलिंग की आवश्यकता: माइकोबैक्टीरियल कोशिकाओं एक मोटी और बहुस्तरीय कोशिका दीवार और लिफाफा कि अपेक्षाकृत lysis के लिए प्रतिरोधी है. इसलिए, हम एक नया लाभ-समारोह रिपोर्टर प्रणाली है कि छोटे संस्करणों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित करने के लिए देखा (उदाहरण के लिए, एक ९६-well प्लेट प्रणाली में) और माप के लिए सेल lysis की आवश्यकता नहीं थी । हम अत्यधिक शक्तिशाली nluc luciferase इस्तेमाल किया और एक महत्वपूर्ण aspartate अवशेषों की पहचान की है कि, जब aspartate को उत्परिवर्तित, समारोह के 2 लॉग नुकसान के परिणामस्वरूप (चित्रा 1) । इसके अलावा, nluc के छोटे आकार यह एक एन टर्मिनल स्राव संकेत टैग के लिए अनुमति दी-antigen 85a से, एक प्रमुख स्रावित प्रतिजन आइसोलेटों में27 -कि nluc संस्कृति supernatant में स्रावित किया जा करने के लिए अनुमति देगा और के लिए आवश्यकता को दरकिनार कोशिका अपघटन । बेंचमार्क प्रोटीन, gfp, उत्परिवर्तित nluc के रूप में एक ही प्रमोटर से व्यक्त किया गया था, लेकिन एक एकीकृत वेक्टर से ( सामग्री की मेजदेखें), और बरकरार कोशिकाओं में मापा जा सकता है21 (चित्रा 3). इन लाभों के बावजूद, Nluc/GFP रिपोर्टर (प्रोटोकॉल की धारा 2) भी नुकसान है: Nluc गतिविधि में अपेक्षाकृत मामूली कमी (१००-गुना) D140N उत्परिवर्तन के साथ बहुत कम mistranslation दरों की माप की अनुमति नहीं होगी, एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में और अधिक उपयुक्त अनुवाद त्रुटि के सटीक माप के लिए रिपोर्टर बनाना । इसके अलावा, Nluc कोई महत्वपूर्ण ग्लूटामेट अवशेषों है; इसलिए, केवल asparagine करने के लिए asparagine त्रुटि दरों मापा जा सकता है । इस काम में वर्णित सामांय सिद्धांतों शोधकर्ताओं या तो इन संवाददाताओं का उपयोग करने की अनुमति के रूप में हम किया है या पत्रकारों को संशोधित के रूप में एक सटीक और/ पसंद.
यहां वर्णित प्रोटोकोल को विविध प्रकार के जीवों में गलत तरीके से छूने की माप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वहां विचार है कि जब अंय प्रणालियों के लिए प्रोटोकॉल अनुकूल मन में रखा जाना चाहिए की एक संख्या हैं । सबसे पहले, माप के उद्देश्य पर विचार किया जाना चाहिए । गलत तरीके से लाभ का उपयोग कर दरों की सही माप के लिए समारोह रिपोर्टरों, क्या जरूरत है (क) एक मजबूत readout परख (जैसे, एंजाइमी समारोह [इस मामले में, luciferase गतिविधि] एक व्यापक रैखिक रेंज के साथ) । इसके अलावा, के लिए देखो (ख) रिपोर्टर प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण अवशेष में समारोह उत्परिवर्तन की हानि है कि समारोह के एक बहुत महत्वपूर्ण नुकसान में, गलत तरीके से की उंमीद की दर से नीचे परिणाम । उदाहरण के लिए, यदि अपेक्षित गलत तरीके से मापी जाने वाली दर लगभग 10-3/codon है, तो प्रकार्य उत्परिवर्तन की हानि को १,००० गुना से अधिक होना चाहिए; अंयथा, गलत तरीके से mistranslation घटनाओं की कम रेंज संवेदनशील पता नहीं किया जाएगा । अंत में, गलत तरीके से लाभ का उपयोग कर दरों की सही माप के लिए समारोह संवाददाताओं, (ग) एक मजबूत बेंचमार्क रिपोर्टर की जरूरत है-इस मामले में, प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 के लिए जुगनू luciferase । आदर्श रूप में, बेंचमार्क रिपोर्टर उत्परिवर्तित एंजाइमी रिपोर्टर, गारंटी (सभी intents और प्रयोजनों के लिए) है कि वे दोनों equimolar अनुपात में व्यक्त कर रहे है के लिए किया जाना चाहिए । बेंचमार्क (और प्राथमिक रिपोर्टर) readout के वातावरण को उजागर करने के लिए perturbations मजबूत होना चाहिए. उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार gfp के प्रतिदीप्ति अत्यधिक क्षोभ के लिए पीएच28में परिवर्तन से अतिसंवेदनशील है, यह एक मानक के रूप में अनुपयुक्त ranslation दरों की माप के लिए एक बेंचमार्क के रूप में मैक्रोफेज, जो में निवास में phagocytosed आइसोलेटों फैगोसोमस जो पीएच 729से नीचे होते हैं । दूसरी ओर, ऐसे छोटे अणु स्क्रीनिंग के रूप में आवेदन के लिए, एक प्राथमिक स्क्रीन के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार (यानी, परिशुद्धता, सटीकता के लिए विरोध के रूप में) माप की reproducibility हो जाएगा, मैनुअल हैंडलिंग की न्यूनीकरण, और छोटे संस्कृति की मात्रा । गलत तरीके से सही माप की दरों में कम महत्वपूर्ण है और माध्यमिक assays हैं के रूप में किया जा सकता है । अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रिपोर्टरों इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, luciferase एंजाइमों के एंजाइमी समारोह के आधार पर, केवल एक जीवाणु आबादी के मतलब mistranslation दरों को मापने लेकिन एकल कोशिका विषमता के बारे में जानकारी नहीं दे सकता गलत तरीके से होने वाली दरों में भिन्नता । अनुकूली फीनोटाइप में एकल कोशिका परिवर्तनशीलता के महत्व को देखते हुए30,31,३२, mistranslation घटनाओं की माप के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों को विकसित किया गया है12,३३ , माइक्रोबैक्टीरिया5में गलत तरीके से करने की माप के लिए शामिल है ।
गलत तरीके से मापने के लिए आवश्यकताओं पर विचार करने के बाद, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आनुवंशिक लाभ-समारोह रिपोर्टरों के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित केवल एक प्रकार के mistranslation उपाय कर सकते हैं (यानी, एक के लिए एक एमिनो एसिड प्रतिस्थापन codon) प्रति रिपोर्टर । इसलिए, विभिंन mistranslation घटनाओं की माप के लिए, कई पत्रकारों की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, एक स्थान पर lysyl-trna द्वारा पास-cognate codons के राइबोसोमल डिकोडिंग त्रुटियों द्वारा गलत तरीके से करने के मापन के लिए, कम से 16 पत्रकारों2,3,11आवश्यक हैं । उच्च परिशुद्धता मास स्पेक्ट्रोमेट्री और bioसूचनाविज्ञान एक साथ mistranslation घटनाओं के कई विभिन्न प्रकार के संभावित पहचान केलिए अनुमति देते हैं; हालांकि, इन तरीकों को भी caveats के साथ आते हैं । सामांय में, वे लाभ के समारोह संवाददाताओं से कम सटीक हैं । इसके अलावा, जैसा कि पहले कहा गया है, वे गलत तरीके से कुछ प्रकार का पता लगाने के लिए कम उपयुक्त हैं, अर्थात् उन है कि nonenzymatic deamidation23के साथ conflated जा सकता है । अंत में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री मध्यम या उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक पढ़ा-बाहर के रूप में अनुपयुक्त है.
इन रिपोर्टरों और अंय प्रणालियों में mistranslation की माप के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए, आगे की बातें वांछित मॉडल प्रणाली में रिपोर्टर की एक मजबूत अभिव्यक्ति शामिल हैं । हम शुरू में दोहरे-luciferase प्रणाली का उपयोग करने का प्रयास किया Farabaugh और सहयोगियों द्वारा संशोधनों के बिना हमारे माइकोबैक्टीरियल प्रणाली में विकसित लेकिन कोई सफलता नहीं थी, रिपोर्टर अभिव्यक्ति की कमी के कारण. व्यापक समस्या निवारण की पहचान की है कि दोनों codon-अनुकूलन और पत्रकारों के एक छोटे से अनुक्रम संशोधन के लिए मजबूत अभिव्यक्ति25 के लिए अनुमति की आवश्यकता थी (और ऊपर देखें) । यह बोधगम्य है कि पत्रकारों के समान रूपांतरों अंय प्रणालियों में उपयोग के लिए आवश्यक होगा ।
अंत में, विचार-विमर्श के प्रकार को मापा जा रहा है । उदाहरण के लिए, यदि कोई रोकने के उपाय की जरूरत है-codon readthrough (बकवास दमन), बंद करो codon समारोह उत्परिवर्तन की हानि के लिए प्राथमिक रिपोर्टर प्रोटीन३४के एक गैर-विचारणीय क्षेत्र के भीतर शुरू की जरूरत है । अंयथा, केवल विशिष्ट बकवास दमन घटनाओं है कि महत्वपूर्ण अवशेष हासिल (और, इसलिए, रिपोर्टर समारोह) परख है, जो संभवतः सच mistranslation दरों की एक पर्याप्त अल्पानुमान के लिए नेतृत्व करेंगे द्वारा मापा जाएगा । इस बात के प्रमाण बढ़ रहे हैं कि स्थानांतरीय त्रुटि जीवों की एक बड़ी संख्या1,12,13,३५में संभावित अनुकूली भूमिका निभाती है । हालांकि, mistranslation घटनाओं की माप अभी भी एक छोटे, हालांकि मॉडल प्रजातियों की बढ़ती संख्या तक ही सीमित है । गलत तरीके से मापने के लिए संवेदनशील तरीकों का अनुकूलन, फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी में अनुवाद की त्रुटि की भूमिका के वैज्ञानिकों की समझ को आगे बढ़ाने की क्षमता है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम बिल और मिलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1109789), चीन के नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (३१५७०१२९) से अनुदान द्वारा समर्थित हिस्से में था, और शुरू हुआ धन Tsinghua विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन से बीजे बीजे के लिए एक वेलकम ट्रस्ट है अन्वेषक (207487/Z/17/Z) ।
Middlebrook 7H9 | BD Difco | 271310 | |
anhydrotetracycline | Cayman Chemical | 10009542 | |
kasugamycin | sigma | K4013 | |
Dual-luciferase reporter assay system | promega | E1960 | |
Nano-Glo luciferase assay | promega | N1120 | |
Fluoroskan Ascent FL luminometer | Thermo | / | |
Assay Plate, 96 Well White, Flat Bottom High Binding, No Lid | Costar | 3922 | |
Assay Plate, 96 Well Black, Flat Bottom High Biding, No Lid | Costar | 3925 | |
96 Well Cell Culture Cluster, Flat Bottom with Lid | Costar | 3599 | |
Non-commercial reagents (plasmids) | |||
pUV-TetOR-RenFF | NA | NA | episomal shuttle plasmid that allows tetracycline-inducible expression of the wild-type dual luciferase reporter |
pUV-TetOR-Ren-D120N-FF | dual-luciferase reporter with mutated Renilla | ||
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N | NA | NA | episomal shuttle plasmid with a tetracyclin-inducible secretable version of mutated Nluc luciferase |
pMC1S-GFP | NA | NA | Mycobacterial integrated (L5 site) vector for tetracycline-inducible expression of GFP |