Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe el aislamiento y el cultivo de explantes de cartílago de rodillas bovinas. Este método proporciona una herramienta fácil y accesible para describir los cambios de tejido en respuesta a estímulos biológicos o nuevas terapias dirigidas a la articulación.
Abstract
Los sistemas de cultivo ex vivo cubren una amplia gama de experimentos dedicados al estudio de la función tisular y celular en un entorno nativo. El cartílago es un tejido único importante para el correcto funcionamiento de la articulación sinovial y está constituido por una matriz extracelular densa (ECM), rica en proteoglicano y colágeno tipo II. Los condrocitos son el único tipo de célula presente dentro del cartílago y son generalizados y relativamente bajos en número. Los estímulos externos alterados y la señalización celular pueden conducir a cambios en la composición y el deterioro de la ECM, que son importantes señas de identidad patológicas en enfermedades como la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide.
Los modelos de cartílago ex vivo permiten 1) perfilar alteraciones mediadas por condrocitos de rotación de tejido de cartílago, 2) visualizar la composición del cartílago ECM y 3) reorganizar condrocitos directamente en el tejido. La elaboración de perfiles de estas alteraciones en respuesta a estímulos o tratamientos son de gran importancia en diversos aspectos de la biología del cartílago, y complementan los experimentos in vitro en condrocitos aislados, o modelos más complejos en animales vivos donde las condiciones experimentales son más difíciles de controlar.
Los explantes de cartílago presentan un método traslacional y de fácil acceso para evaluar la remodelación de tejidos en el ECM del cartílago en entornos controlables. Aquí, describimos un protocolo para aislar y cultivar explantes vivos de cartílago bovino. El método utiliza tejido de la rodilla bovina, que es fácilmente accesible desde la carnicería local. Tanto los explantas como el medio de cultivo condicionado se pueden analizar para investigar la rotación de tejidos, la composición de ECM y la función de condrocitos, lo que genera perfiles de modulación de ECM.
Introduction
Los condrocitos producen y mantienen la matriz del cartílago. Con el fin de estudiar la biología de los condrocitos y cómo ellos y el ECM circundante reaccionan a los estímulos externos, es crucial interrogarlos en su entorno nativo1,2. El estudio de la rotación del tejido del cartílago es importante para aumentar la comprensión de los mecanismos subyacentes en enfermedades articulares como la OA, una enfermedad para la que actualmente no existe un tratamiento modificador de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de mejores modelos de traducción2.
La caracterización ex vivo de los efectos celulares y tisulares es esencial para complementar otros modelos preclínicos, tanto in vitro, como cultivos monocapa de condrocitos, como in vivo, como modelos de OA inducidos por cirugía o el modelo de artritis autoinmune inducida por colágeno (CIA ). Numerosos estudios han destacado las diferencias entre cómo se comportan las células en cultivos monocapa 2D y estructuras 3D o en su tejido nativo3,4. Muchas células en capas 2D adoptan morfologías no naturales, incluyendo diferencias en la polaridad celular y la unión tisular, lo que resulta en diferencias visuales y funcionales en las células dentro de los tejidos nativos5. Las diferencias también son evidentes en la funcionalidad de las células, que pueden desplazar la expresión de proteínas, lo que conduce a patrones de diferenciación profundamente alterados, maquinaria reguladora y funcionalidad celular5,6,7 ,8.
El eCM del cartílago consiste principalmente en colágeno tipo II que proporciona un marco de matriz, y agrecan, un proteoglicano que ayuda a retener el líquido dentro del tejido. Otras moléculas de matriz como colágeno tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteína oligomérica del cartílago (COMP), biglycan, decorin, y perlecan también están presentes9.
Mientras que la etiología de OA sigue sin estar clara10,11, la aparición de la enfermedad se cree que es causada por desequilibrios en los procesos de rotación y reparación de tejidos12,13. La degradación del cartílago articular es un sello distintivo de la OA. Los condrocitos o células residentes en el cartílago en los tejidos circundantes aumentan su liberación de citoquinas, estimulando la producción elevada de proteinasas como las metaloproteinasas matriciales (MMP) y las agresorasas, que aumentan la degradación del cartílago ECM 14. Esta degradación da lugar a la liberación de pequeños fragmentos de proteína únicos llamados neoepítos, que se pueden cuantificar en suero, orina o medio de cultivo15. Tras la formación y maduración del colágeno, también se liberan los llamados profragmentos; estos pueden cuantificarse como medida de la producción de matriz16.
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo de cartílago ex vivo para comparar el efecto de la estimulación y/o el tratamiento farmacológico en la rotación de tejido SCM. La rotación del cartílago se perfila midiendo biomarcadores de neoepitopos derivados de la matriz directamente en el medio de cultivo condicionado utilizando ELISA: AGNx1 (que refleja la actividad de la agresorasa), C2M (que refleja la actividad de MMP de matriz) y ProC2 (reflejando colágeno tipo II formación). Los hallazgos pueden ser verificados por la tinción histológica del ECM, que también visualiza la organización de los condrocitos en los explantes individuales. El protocolo descrito se puede utilizar para probar el efecto de nuevos tratamientos sobre la función de condrocitos y la rotación de ECM de cartílago. Varios estudios han utilizado explantes de cartílago para describir procesos biológicos o el efecto de la intervención en explantes con problemas de citoquinas utilizando enfoques histológicos o inmunohistoquímicos cuantitativos, ARNm, expresión de proteínas o proteómica2 ,17,18. Sin embargo, estos protocolos están fuera del alcance del manuscrito actual.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí para la elaboración de perfiles de rotación de tejido de cartílago en explantas de cartílago bovino se puede utilizar para caracterizar los efectos del tratamiento de muchos tipos de fármacos, incluidos los inhibidores de las vías intracelulares inflamatorias, los inhibidores de enzimas proteolíticas, o factores de crecimiento anabólicos.
En este protocolo se describieron dos configuraciones diferentes: una configuración anabólica en la que se estimularo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal técnico de Nordic Bioscience el apoyo de laboratorio, así como a la Fundación Danesa de Investigación por el apoyo general a nuestra investigación.
Materials
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
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