Hurtig generering af primære murine melanocyte og fibroblast kulturer
Summary
Denne protokol skitserer en hurtig metode til samtidig generere melanocyt og fibroblast kulturer fra huden af 0-4 dag gamle mus. Disse primære kulturer kan vedligeholdes og manipuleres in vitro for at studere en række fysiologisk relevante processer, herunder hudcelle biologi, pigmentering, sårheling og melanom.
Abstract
Defekter i fibroblast eller melanocyt funktion er forbundet med hudsygdomme, herunder dårlig barriere funktion, defekt sårheling, pigmentering defekter og kræft. Afgørende for forståelsen og forbedring af disse sygdomme er eksperimenter i primær fibroblast og melanocyt kulturer. Ikke desto mindre kræver nuværende protokoller for melanocyt isolation, at hudens epidermal og dermal lag er trypsinseret og manuelt frakoblet. Denne proces er tidskrævende, teknisk udfordrende og bidrager til inkonsekvente udbytter. Desuden er metoder til samtidig generering af rene fibroblast kulturer fra samme vævsprøve ikke umiddelbart tilgængelige. Her beskriver vi en forbedret protokol til isolering af melanocytter og fibroblaster fra huden på mus på postnatale dage 0-4. I denne protokol er hele huden mekanisk homogeniseret ved hjælp af en vævs chopper og derefter kortvarigt fordøjet med kollagenase og trypsin. Cellepopulationer isoleres derefter gennem selektiv plating efterfulgt af G418 behandling. Denne procedure resulterer i konsistente melanocyt og fibroblast udbytter fra en enkelt mus i mindre end 90 min. Denne protokol er også let skalerbar, så forskerne kan behandle store kohorter af dyr uden en betydelig stigning i hands-on tid. Vi viser gennem flow cytometriske vurderinger, at kulturer etableret ved hjælp af denne protokol er meget berigede for melanocytter eller fibroblaster.
Introduction
Pattedyrs hud er et flerlags organ, der beskytter kroppen mod fremmede patogener og ultra violet bestråling (UVR). Huden spiller også en afgørende rolle i homeostatiske processer såsom sårheling, temperaturregulering og D-vitaminproduktion1,2,3. Pattedyrs hud består af tre store celletyper: melanocytter, fibroblaster og keratinocytter. Disse celletyper befolker forskellige lag af huden, med keratinocytter udgør epidermis, fibroblaster bosiddende i dermis og melanocytter lokaliserer til epidermal-dermal Junction og hårsækkene4. Her, vi detaljeret en simpel procedure, der muliggør den samtidige generation af primære melanocyt og fibroblast kulturer fra murine hud.
Melanocytter er pigment-producerende celler findes i mange steder i hele den menneskelige krop, herunder basal epidermis, iris, cochlea, hjernen og hårsækkene5. Den primære funktion af melanocytter er at generere og udskille melanin-holdige vesikler kaldet melanosomer pigmentgranula5,6. Melanosomer indeholder to store klasser af melanin: brun/sort eumelanin og gul/rød pheomelanin6,7. Biokemiske processer i melanocyt regulere den relative overflod af hver melanin arter og hjælpe med at bestemme hår, hud og øjenfarve8,9. Melanin tjener også til at absorbere UVR og beskytte solbeskinnede væv fra mutagenese10.
Melanocyt dysfunktion kan forårsage pigmentære defekter og øge hudkræft modtagelighed. For eksempel, hyper-pigmenteret hud patches karakteristisk for melasma er resultatet af fokal melanin overproduktion, mens kimcelle genetiske mutationer, som kompromitterer gener involveret i melanin syntese føre til albinisme11,12 . Intim viden om melanocyt biologi er nødvendig for at udvikle strategier, der vil korrigere sådanne pigmentære defekter og i sidste ende forbedre den psykosociale velbefindende for personer, som er plaget af disse sygdomme. Underskud i melanin produktion og/eller præference syntesen af pheomelanin er også forbundet med øget hudkræft risiko10. Denne risiko menes at skyldes reduceret UVR-beskyttelse6,13. Således, metoder til at forbedre eller genoprette eumelanin produktion i melanocytter kan reducere forekomsten af hudkræft i disse populationer.
Mesenchymal fibroblaster etablere bindevæv og strukturel støtte til alle organer i kroppen, herunder dermal lag af huden14. Udskillelse af proteiner som kollagen, elastin, Laminin og fibronektin gør det muligt for fibroblaster at danne den ekstracellulære matrix (ECM), der er afgørende for vævs integriteten1,14. Fibroblaster spiller også vigtige roller i processer som sårheling, inflammation, angiogenese og kræft dannelse/progression1,15,16.
Svarende til melanocytter, defekter i fibroblast aktivering og funktion kan fremme tumor og sygdom. For eksempel, uhensigtsmæssig fibroblast aktivering almindeligvis fører til dannelsen af fibrose, som følge af den forbedrede aflejring af overskydende ECM komponenter i det omgivende væv. Som fibroblaster opretholde en stor del af kroppens strukturelle integritet, fibrose fremmer sygdomme, der påvirker talrige væv og organer, herunder idiopatisk pulmonal fibrose, systemisk sklerose, levercirrhose og hjertefibrose15. Fibroblaster spiller også en afgørende rolle i Cancer16. Cancer associeret fibroblaster (CAFs) er de mest udbredte ikke-maligne celler i mikromiljøet af mange tumorer. CAFs har vist sig at fremme tumor proliferation, progression og terapeutisk resistens ved at moduere vævs stivhed, lokal cytokin produktion og immun funktion16.
Primære cellekulturer giver forskere med genetisk Tractable modeller til at identificere og afbøde melanocyt og fibroblast defekter, der fører til sygdom. Men, nuværende metoder til at etablere melanocyt kulturer er tidskrævende og teknisk udfordrende. Behovet for trypsinisering og følsom adskillelse af epidermis og dermis bidrager til variabilitet i forsøgs udbyttet og gør det vanskeligt at udføre store eksperimenter. Endvidere, protokoller til samtidig isolere melanocytter og fibroblaster fra hele huden er i øjeblikket mangler i marken.
Vi har udviklet en metode til at reducere behandlingstrinnene, variabilitet og tid, der kræves for at etablere melanocyt-og fibroblast kulturer fra samme hele hudprøve. Ved hjælp af en mekanisk homogenisering metode efterfulgt af en kort fordøjelse, vores strategi betydeligt nedsætter mængden af hands-on tid, der kræves for at isolere primære melanocytter samtidig muliggør samtidig fibroblast isolation. Den øgede hastighed, effektivitet og konsistens i denne protokol, i kombination med evnen til at isolere melanocytter fra 0-4 dag gamle mus, giver forskerne fleksibilitet til at udføre en bredere vifte af eksperimenter end tidligere muligt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro-kulturen af primære melanocytter og fibroblaster har ført til betydelige fremskridt i vores forståelse af hudens biologi og sygdom. Denne protokol forbedrer efter forudgående melanocyt isolation metoder ved at reducere den tid og teknisk kyndige nødvendig for at generere konsistente melanocytter kulturer samtidig give mulighed for samtidig isolering af huden fibroblaster. En roman, tidsbesparende element i denne procedure er, at dermis og epidermis ikke behøver at være adskilt. I stedet er hudceller isole…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 til C.E.B.) og Pelotonia (B.M.M.) for økonomisk støtte. Vi er taknemmelige for C. Haines og C. Wormsbaecher, der fremsatte kommentarer til at forbedre manuskriptet tekst. Dette arbejde nød godt af Ohio State Comprehensive Cancer Centers analytiske cytometry-delte ressource, som understøttes af NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
