Génération rapide de cultures de murine primaire et de fibroblaste
Summary
Ce protocole décrit une méthode rapide pour générer simultanément des cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir de la peau de souris de 0 à 4 jours. Ces cultures primaires peuvent être maintenues et manipulées in vitro pour étudier une variété de processus physiologiquement pertinents, y compris la biologie des cellules de la peau, la pigmentation, la cicatrisation des plaies et le mélanome.
Abstract
Les défauts dans la fonction de fibroblaste ou de maulanocyte sont associés aux maladies de peau, y compris la fonction pauvre de barrière, la guérison défectueuse de blessure, les défauts de pigmentation et le cancer. Des expériences dans les cultures primaires de fibroblaste et de mélinocytes sont essentielles à la compréhension et à l’amélioration de ces maladies. Néanmoins, les protocoles actuels pour l’isolement de mlanocyte exigent que les couches épidermiques et cutanées de la peau soient trypsinisées et manuellement dissociées. Ce processus prend du temps, est techniquement difficile et contribue à des rendements incohérents. En outre, les méthodes pour générer simultanément des cultures pures de fibroblaste à partir du même échantillon de tissu ne sont pas facilement disponibles. Ici, nous décrivons un protocole amélioré pour isoler des mlanocytes et des fibroblastes de la peau des souris les jours postnatals 0-4. Dans ce protocole, la peau entière est mécaniquement homogénéisée à l’aide d’un hachoir à tissu, puis brièvement digérée avec de la collagène et de la trypsine. Les populations cellulaires sont ensuite isolées par placage sélectif suivi du traitement G418. Cette procédure entraîne des rendements cohérents de mlanocyte et de fibroblaste d’une souris simple en moins de 90 min. Ce protocole est également facilement évolutif, permettant aux chercheurs de traiter de grandes cohortes d’animaux sans une augmentation significative du temps pratique. Nous montrons à travers des évaluations cytométriques de flux que les cultures établies à l’aide de ce protocole sont fortement enrichies pour les mlanocytes ou les fibroblastes.
Introduction
La peau des mammifères est un organe multicouches qui protège le corps contre les agents pathogènes étrangers et l’irradiation ultra-violette (UVR). La peau joue également un rôle critique dans les processus homéostatiques tels que la cicatrisation des plaies, la régulation de la température et la production de vitamine D1,2,3. La peau des mammifères se compose de trois principaux types de cellules : les mlanocytes, les fibroblastes et les kératinocytes. Ces types de cellules peuplent différentes couches de la peau, avec des kératinocytes constituant l’épiderme, des fibroblastes résidant dans le derme et les mlanocytes se localisant à la jonction épidermique-dermique et les follicules pileux4. Ici, nous détaillons une procédure simple qui permet la génération simultanée des cultures primaires de maulanocyte et de fibroblaste de peau murine.
Les mlanocytes sont des cellules productrices de pigments que l’on trouve dans de nombreux endroits du corps humain, y compris l’épiderme basal, l’iris, la cochlée, le cerveau et les follicules pileux5. La fonction principale des mélonocytes est de générer et de sécréter des vésicules contenant de la mélanine appelées mélanosomes5,6. Les mélanosomes contiennent deux grandes classes de mélanine : l’eumélanine brune/noire et la phéomélanine jaune/rouge6,7. Les processus biochimiques dans le mlanocyte régulent l’abondance relative de chaque espèce de mélanine et aident à déterminer la couleur des cheveux, de la peau et des yeux8,9. La mélanine sert également à absorber les rayons UV et à protéger les tissus exposés au soleil de la mutagénèse10.
Le dysfonctionnement de mlanocyte peut causer des défauts pigmentaires et augmenter la susceptibilité de cancer de peau. Par exemple, les taches hyper-pigmentées de peau caractéristiques du mélasma sont le résultat de la surproduction focale de mélanine, alors que les mutations génétiques germinales qui compromettent des gènes impliqués dans la synthèse de mélanine mènent à l’albinisme11,12 . Une connaissance intime de la biologie des mlanocytes est nécessaire pour élaborer des stratégies qui corrigeront ces défauts pigmentaires et, en fin de compte, amélioreront le bien-être psychosocial des personnes atteintes de ces maladies. Les déficits dans la production de mélanine et/ou la synthèse préférentielle de la phéomélanine sont également associés au risque accru de cancer de la peau10. On pense que ce risque résulte d’une protection réduite contre les rayons UV6,13. Ainsi, les méthodes pour améliorer ou restaurer la production d’eumélanine dans les mlanocytes peuvent réduire l’incidence du cancer de la peau dans ces populations.
Les fibroblastes mésenchymales établissent le tissu conjonctif et le soutien structurel pour tous les organes du corps, y compris la couche cutanée de la peau14. L’excrétion de protéines telles que le collagène, l’élastine, la lamininine et la fibronectine permettent aux fibroblastes de former la matrice extracellulaire (ECM) qui est essentielle à l’intégrité des tissus1,14. Les fibroblastes jouent également un rôle essentiel dans des processus tels que la cicatrisation des plaies, l’inflammation, l’angiogenèse et la formation/progression du cancer1,15,16.
Semblable aux mlanocytes, les défauts dans l’activation et la fonction de fibroblaste peuvent favoriser la tumorigenesis et la maladie. Par exemple, l’activation inappropriée de fibroblaste mène généralement à la formation de la fibrose, résultant du dépôt accru des composants excédentaires d’ECM dans le tissu environnant. Comme les fibroblastes maintiennent une grande partie de l’intégrité structurelle du corps, la fibrose favorise les maladies qui affectent de nombreux tissus et organes, y compris la fibrose pulmonaire idiopathique, la sclérose systémique, la cirrhose du foie et la fibrose cardiaque15. Les fibroblastes jouent également un rôle essentiel dans le cancer16. Les fibroblastes associés au cancer (CAF) sont les cellules non malignes les plus abondantes dans le microenvironnement de nombreuses tumeurs. Il a été démontré que les FCA favorisent la prolifération, la progression et la résistance thérapeutique des tumeurs en modulant la rigidité des tissus, la production locale de cytokine et la fonction immunitaire16.
Les cultures cellulaires primaires fournissent aux chercheurs des modèles génétiquement traitables pour identifier et atténuer les défauts de mlanocyte et de fibroblaste qui mènent à la maladie. Cependant, les méthodes actuelles pour établir les cultures de mlanocytes sont longues et techniquement provocantes. Le besoin de trypsinisation et de séparation délicate de l’épiderme et du derme contribue à la variabilité du rendement expérimental et rend difficile l’exécution d’expériences à grande échelle. En outre, les protocoles pour isoler simultanément les mlanocytes et les fibroblastes de la peau entière font actuellement défaut dans le domaine.
Nous avons mis au point une méthode pour réduire les étapes de traitement, la variabilité et le temps requis pour établir les cultures de mlanocytes et de fibroblastes à partir du même échantillon de peau entier. À l’aide d’une méthode d’homogénéisation mécanique suivie d’une brève digestion, notre stratégie diminue considérablement le temps pratique nécessaire pour isoler les mlanocytes primaires tout en permettant l’isolement simultané du fibroblaste. La vitesse, l’efficacité et la cohérence accrues de ce protocole, combinées à la capacité d’isoler les mlanocytes des souris de 0 à 4 jours, offrent aux chercheurs la flexibilité nécessaire pour effectuer un plus large éventail d’expériences qu’auparavant.
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture in vitro des mlanocytes primaires et des fibroblastes a mené à des progrès significatifs dans notre compréhension de la biologie de peau et de la maladie. Ce protocole améliore les méthodes antérieures d’isolement des mlanocytes en réduisant le temps et le sens technique nécessaires pour générer des cultures cohérentes de mlanocytes tout en permettant l’isolement simultané des fibroblastes de peau. Un élément nouveau et salvateur de cette procédure est que le derme et l’épiderme n’ont pas beso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient la Fondation Damon Runyon (Prix de l’innovation #38-16 ans à C.E.B.) et Pelotonia (B.M.M.) pour leur soutien financier. Nous sommes reconnaissants à C. Haines et C. Wormsbaecher qui ont fourni des commentaires pour améliorer le texte du manuscrit. Ce travail a bénéficié de l’Ohio State Comprehensive Cancer Center’s Analytical Cytometry Shared Resource qui est soutenu par NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
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