הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.
Abstract
פגמים בטיפול בפיברולגון או בתפקוד מלנוציט קשורים למחלות עור, כולל תפקוד המכשול המסכן, ריפוי בפצע פגום, פגמים בפיגמנטציה וסרטן. חיוני להבנה ולנאום של מחלות אלו הם ניסויים בתרבויות היסוד בגידולים ובתרביות מלנוציט. עם זאת, הפרוטוקולים הנוכחיים עבור בידוד מלנוציט דורשים כי שכבות באפידרמיס העורי של העור הם טריסינטזציה ומנותק ידנית. תהליך זה הוא זמן רב, טכנית מאתגרת ותורמת התפוקה לא עקבית. יתר על כן, שיטות לייצר בו תרבויות טהור העור מאותו דגימת רקמות אינם זמינים בקלות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור בידוד המלנוציטים והפיברוהכדורים מהעור של העכברים ביום לאחר הלידה 0-4. בפרוטוקול זה, העור השלם הוא הומוגניים מכנית באמצעות מסוק רקמה ולאחר מכן מתעכל בקצרה עם הקולגן וטריפסין. אוכלוסיות תאים מבודדות אז באמצעות ציפוי סלקטיבי ואחריו טיפול G418. הליך זה מביא התשואות עקבית מלנוציט ופיברוהפיצוץ מעכבר בודד פחות מ 90 דקות. פרוטוקול זה גם מדרגי בקלות, ומאפשר לחוקרים לעבד כפות גדולות של בעלי חיים ללא עלייה משמעותית בזמן. אנו מציגים באמצעות שימוש בהערכות הסייטוטומטריות שתרבויות שהוקמו באמצעות פרוטוקול זה מועשר במידה רבה עבור מלנוציטים או פיברוהריות.
Introduction
העור הוא איבר רב שכבתי המגן על הגוף מפני פתוגנים זרים והקרנה אולטרה סגולה (UVR). העור גם משחק תפקיד קריטי הומסטטי תהליכים כגון ריפוי הפצע, בקרת טמפרטורה וויטמין D הפקה1,2,3. העור של המיונקים מורכב משלושה סוגי תאים עיקריים: מלנוציטים, פיברונוציטים ו keratinocytes. אלה סוגי תאים לאכלס שכבות שונות של העור, עם keratinocytes ממציא את האפידרמיס, הגידולים המתגוררים בתוך דרמיס ו מלנוציטים לקשר באפידרמיס העור וזקיקי השיער4. כאן, אנו מפרטים הליך פשוט המאפשר את הדור המקביל של התרבויות הראשיות מלנוציט ופיברובלסט מעור מורלין.
מלנוציטים הם תאים המייצרים פיגמנט נמצא במקומות רבים ברחבי הגוף האנושי, כולל האפידרמיס הבזליים, איריס, שבלול, המוח וזקיקי השיער5. הפונקציה העיקרית של מלנוציטים היא לייצר ולהפריש מלנין המכילים שלפוחיות בשם מלאנוזומים5,6. מלאנוזומים מכילים שני מחלקות עיקריות של מלנין: מלנין חום/שחור וצהוב/בצבע אדום-פאומאלאנין6,7. תהליכים ביוכימיים בתוך המליוציט מווסת את השפע היחסי של כל מיני מלנין ומסייעים לקבוע את צבע השיער, העור והעין8,9. מלנין משמש גם לקלוט UVR ולהגן על רקמות חשופות השמש מ מוטגנזה10.
תפקוד מלנוציט יכול לגרום לפגמים פיגמנטרים ולהגדיל את הרגישות לסרטן העור. לדוגמה, העור hyper-פיגמנט מאפיין המאפיינים של מלזמה הם תוצאה של ייצור overproduction מלנין מוקד, ואילו germline מוטציות גנטיות אשר להתפשר על גנים מעורב סינתזה מלנין להוביל לבקנות11,12 . ידע אינטימי של ביולוגיה של מלנוציט נדרש לפתח אסטרטגיות שיתקנו פגמים פיגמנטרים כאלה ובסופו של דבר לשפר את הרווחה הפסיכופסיכו של אנשים הנגועים במחלות אלה. להגרעונות בייצור מלנין ו/או הסינתזה המוועדף של פאנדואנאין משויכים גם לסרטן העור מוגבר סיכון10. סיכון זה הוא האמין תוצאה של הגנה מופחתת uvr6,13. כך, שיטות לשפר או לשחזר הייצור האומלנין במלנוציטים עשוי להפחית את השכיחות של סרטן העור באוכלוסיות אלה.
מססניקל פיברולליים לבסס את רקמת החיבור ואת התמיכה המבנית עבור כל אברי הגוף, כולל השכבה העורי של העור14. הפרשה של חלבונים כגון קולגן, אלסטין, למינציה ו fibronectin לאפשר פיברוהפיצוצים כדי ליצור את מטריקס מסחטות (ecm) כי הוא חיוני עבור שלמות רקמות1,14. פיברותקיעות גם לשחק תפקידים חיוניים בתהליכים כגון ריפוי הפצע, דלקת, אנגיוגנזה והיווצרות סרטן/התקדמות1,15,16.
בדומה למלנוציטים, פגמים בהפעלת פיברובלסט ובתפקוד יכולים לקדם את המחלה בטווריגנזה ובמחלות. לדוגמה, הפעלה בלתי הולמת פיברוהפיצוץ מוביל בדרך כלל להיווצרות פיברוזיס, וכתוצאה מכך ההצהרה המשופרת של רכיבי ECM עודף לתוך הרקמה הסובבת. כמו הפיברותקיעות לשמור על הרבה של הגוף שלמות מבנית, פיברוזיס מקדם מחלות המשפיעות על רקמות ואיברים רבים, כולל פיברוזיס הריאות אידיופטית, טרשת מערכתית, שחמת הכבד ופיברוזיס של הלב15. פיברותקיעות גם לשחק תפקיד קריטי בסרטן16. סרטן הקשורים לפיברותקיעות (CAFs) הם התאים הנפוצים ביותר שאינם ממאירים ב מיקרוסביבה של גידולים רבים. CAFs הוכחו לקדם התפשטות הגידול, התקדמות ההתנגדות הטיפולית על ידי קשיות רקמות מאופייגטיים, הייצור cy, המקומי ותפקוד החיסון16.
תרביות תאים ראשוניים לספק חוקרים עם מודלים מגנטי מגנטית לזהות ולהמתיק פגמים מלנוציט ופיברובלסט המובילים למחלות. עם זאת, שיטות נוכחיות להקמת תרבויות מלנוציט הן זמן רב ומאתגרות באופן טכני. הצורך בטריסיזציה והפרדה עדינה של האפידרמיס והדרסטיות תורמת לשונות בתפוקה הניסיונית ומקשה על ביצוע ניסויים בקנה מידה גדול. יתר על כן, הפרוטוקולים לבידוד בו הפיברוציטים מעור שלם חסרים כרגע בשדה.
פיתחנו שיטה כדי להפחית את שלבי העיבוד, השונות והזמן הנדרש כדי ליצור תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מאותה דגימת עור כולה. באמצעות שיטת הומוקות מכנית ולאחריה עיכול קצר, האסטרטגיה שלנו מקטינה באופן משמעותי את כמות הידיים על הזמן הנדרש כדי לבודד את המלנוציטים הראשוניים תוך הפיכת בידוד פיברופיצוץ במקביל. מהירות מוגברת, יעילות ועקביות של פרוטוקול זה, בשילוב עם היכולת לבודד מלנוציטים מ 0-4 ביום העכברים הישנים, מספק לחוקרים את הגמישות לבצע מגוון רחב יותר של ניסויים מאשר אפשרי בעבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
התרבות החוץ-גופית של המלנוציטים והפיברומוטיות הראשונית הובילה להתקדמות משמעותית בהבנת הביולוגיה והמחלות של העור. פרוטוקול זה משתפר בשיטות הבידוד הקודמות של מלנוציט על-ידי הפחתת הזמן והניסיון הטכני הדרושים ליצירת תרבויות מלנוציט עקביות תוך התרת הבידוד הסימולטני של העור. רומן, חסכון בזמ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לקרן דיימון ראניון (38-16 ל-C.E.B.) ופלואוטוניה (B.M.M.) לתמיכה כספית. אנחנו אסירי תודה לג היינס ולג וורmsbacher שסיפקו הערות לשיפור הטקסט בכתב היד. עבודה זו הסיוע מתוך מדינת אוהיו מקיף הסרטן המרכז האנליטי Cy, משאב משותף הנתמך על ידי NIH P30 CA016058.
Materials
| 0.2 µm PES sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 352008 | |
| 6-well cell culture dish | Sigma-Aldrich | SIAL0516 | |
| 70 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | |
| CF 488A Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92273 | |
| CF 555 Mix-n-Stain Antibody Labeling Kit | Biotium | 92274 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Collagen from rat tail | Sigma-Aldrich | C7661 | |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemicals | LS004156 | |
| Corning Penicillin/Streptomycin Solution | Fisher Scientific | 30-002-CL | |
| Cytokeratin 14 Antibody Alexa Fluor 647 | Novus Biologicals | NBP2-34403AF647 | |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemicals | LS002058 | |
| Di-butyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 12800-082 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 22032601 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| FSP1/S100A4 antibody | Millipore Sigma | 07-2274 | |
| G418 Disulfide | P212121 | LGB-418-1 | |
| Glacial Acetic Acid | VWR | VWRV0714 | |
| Horse Serum | Fisher Scientific | 26050088 | |
| HyClone L-Glutamine | Fisher Scientific | SH3003402 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10180 | |
| Melanoma gp100 antibody | Abcam | ab137078 | |
| Nutrient Mix F-12 Ham's Media | Sigma-Aldrich | N6760 | |
| Phorbol 12-Myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | |
| Porcine Trypsin | Sigma-Aldrich | 85450C | |
| RPMI 1640 media | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S-7900 | |
| Tissue Chopper Blade | Ted Pella | 121-6 | |
| Tissue Chopper Plastic Disk | Ted Pella | 10180-01 | |
| Trypsin | VWR | VWRL0154-0100 |
References
- Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals. Journal of Cell Communucation and Signal. 10 (2), 103-120 (2016).
- Romanovsky, A. A. Skin temperature: its role in thermoregulation. Acta Physiologica (Oxf). 210 (3), 498-507 (2014).
- Holick, M. F., Smith, E., Pincus, S. Skin as the site of vitamin D synthesis and target tissue for 1,25-dihydroxyvitamin D3. Use of calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) for treatment of psoriasis. Archives of Dermatology. 123 (12), 1677-1683 (1987).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35 (2), 193-199 (2009).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Melanocytes and their diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (5), (2014).
- Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochemistry and Photobiology. 84 (3), 539-549 (2008).
- Thody, A. J., et al. Pheomelanin as well as eumelanin is present in human epidermis. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (2), 340-344 (1991).
- Swope, V. B., Abdel-Malek, Z. A. MC1R: Front and Center in the Bright Side of Dark Eumelanin and DNA Repair. International Journal of Molecular Science. 19 (9), (2018).
- Barsh, G. S. What controls variation in human skin color. PLoS biology. 1 (1), 27 (2003).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Research. 13, 156-162 (2000).
- Gronskov, K., Ek, J., Brondum-Nielsen, K. Oculocutaneous albinism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 2, 43 (2007).
- Kwon, S. H., Hwang, Y. J., Lee, S. K., Park, K. C. Heterogeneous Pathology of Melasma and Its Clinical Implications. International Journal of Molecular Sciences. 17 (6), (2016).
- D’Orazio, J., Jarrett, S., Amaro-Ortiz, A., Scott, T. UV radiation and the skin. International Journal of Molecular Science. 14 (6), 12222-12248 (2013).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Kendall, R. T., Feghali-Bostwick, C. A. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Frontiers in Pharmacology. 5, 123 (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
