Beredning och tillämpning av en ny bakteriell bio sensor för presumtiva upptäckten av Gunshot rester

Summary

Ett protokoll presenteras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att syntetisera en uppsättning av bakteriella bio sensorer för analys av skott rester, och för att testa driften av enheterna för deras avsedda användning med fluorescensspektroskopi.

Abstract

MicRoboCop är en bio sensor som har utformats för en unik tillämpning inom kriminal teknisk kemi. MicRoboCop är ett system som består av tre enheter som, när de används tillsammans, kan indikera förekomsten av skott rester (GSR) genom att producera en fluorescenssignal i närvaro av tre nyckelanalyter (antimon, bly och organiska komponenter av GSR). Protokollet beskriver syntesen av bio sensorerna med Escherichia coli (E. coli), och de analytiska kemi metoder som används för att utvärdera sensorernas selektivitet och känslighet. Systemets funktion demonstreras med hjälp av GSR som samlats in från insidan av ett använt patron hölje. När de har förberetts kan bio sensorerna lagras tills de behövs och kan användas som ett test för dessa nyckelanalyter. Ett positivt svar från alla tre Analyterna ger ett presumtivt positivt test för GSR, medan varje enskild enhet har tillämpningar för detektering av Analyterna i andra prover (t. ex. en detektor för bly förorening i dricks vatten). Den huvudsakliga begränsningen av systemet är den tid som krävs för en positiv signal; framtida arbete kan innebära att studera olika organismer för att optimera responstiden.

Introduction

En bio sensor är en analytisk enhet som använder biologiska komponenter (t. ex. proteiner, nukleinsyror eller hela organismer) som ger ett svar som kan användas för detektion av ett kemiskt ämne eller en analyt. Som ett exempel, använde kol gruv industrin en bio sensor för mycket av 20-talet för att upptäcka förekomsten av giftiga gruv gaser: Kanarie fågeln i kol gruvan¹. Den biologiska organismens (Kanarie öarnas) reaktion (död eller ångest) på en kemisk analyt (kolmonoxid) observerades av gruv arbetarna för att skydda arbetarna. I ett mer modernt och sofistikerat exempel kan bakterier ändras med hjälp av syntetiska bio Logi tekniker för att svara på närvaron av en viss kemisk analyt genom att ställa ut ett specifikt svar, såsom uttryck av ett fluorescerande protein.

Syntetisk biologi är ett brett begrepp som hänvisar till byggandet av biologiska anordningar och system som inte existerar naturligt, eller omkonstruktion av befintliga biologiska system för ett specifikt ändamål². Syntetisk biologi skiljer sig från gen teknik genom en standard metodik och förekomsten av standardiserade delar (standard syntetiska biologi genetiska element) som kan användas för att syntetisera enheter och system. En del förs in i genomet av en anordning, en organism som en bakterie, att uttrycka en viss egenskap som kommer att fungera som en indikation på funktion. I många syntetiska produkter introduceras till exempel ett fluorescerande protein i en enda celledorganism som ett reporter protein. Flera enheter kan kombineras till ett system. Genom mikroorganismer som bakterier är lätta att manipulera på detta sätt. Många exempel på bio sensorer som är specifika för ett brett spektrum av kemiska analyter har rapporter ATS i litteraturen under det senaste decenniet^3,4.

I detta arbete är MicRoboCop systemet presenteras som ett exempel på en bio sensor utformad med hjälp av syntetiska biologi tekniker med nya tillämpningar i kriminal teknisk och miljö kemi. MicRoboCop är ett system med tre separata enheter som, när de kombineras, kommer att göra det möjligt Escherichia coli att uttrycka rött fluorescerande protein (RFP) i närvaro av skott rester (GSR) som har samlats in från en persons händer eller en yta. Var och en av de tre enheterna reagerar på en specifik kemisk analyt som är känd för att vara en del av GSR⁵. De tre analyter som systemet svarar på är I. 2, 4, 6-trinitrotoluen (TNT) och besläktade föreningar, II. bly (i form av bly joner) och III. Antimon (även i form av joner).

GSR består av många olika kemiska ämnen, men de tre som vanligt vis används för att identifiera en rest som GSR är barium, bly, och antimon⁵. Det standardiserade bevis provet för identifiering av GSR är att använda scanning elektronmikroskopi (SEM) med energidispersiv röntgen fluorescens (EDX)⁵. SEM-EDX gör det möjligt för analytiker att identifiera den unika morfologin och elementär komponenterna i GSR. För närvarande finns det få utbredda binära presumtiva tester tillgängliga. En nyligen publicerad presumtiva test använder Jon-rörlighet spektroskopi (IMS), som är specialiserad utrustning som kanske inte finns i många Labs⁶. Det finns också några färg “spot”-tester som kan användas, även om de vanligt vis används för avstånds bestämning eller för GSR identifiering på kula hål och sår⁵. Dessutom har det förekommit viss begränsad uppmärksamhet i litteraturen till elektrokemiska tester för GSR som sysselsätter voltammetrisk analys, som har fördelen av att potentiellt vara fältet portabel, eller Anodisk strippning voltametri, vilket är en extremt känslig metod för metalliska element⁷. Det finns mycket lite omnämnande i litteraturen av bio sensorer som utformats speciellt för att upptäcka GSR, även om vissa bio sensorer för andra kriminal tekniska tillämpningar har publicerats⁸.

De biologiska elementen för varje enhet i MicRoboCop-systemet, och plasmidkonstruktionen, illustreras i figur 1. Den böjda pilen i figur 1b representerar den promotor region som aktive ras i närvaro av analyten, ovalen är den ribosomala bindnings platsen som tillåter översättning av reporterproteinet, den grå rutan märkt RFP är den gen som uttrycker röd fluorescerande protein, och den röda Oktagonen är transkriptionsterminerings platsen. Alla tre enheter kommer att användas tillsammans som ett system för att upptäcka GSR. Varje enhet med en specifik promotor (SbRFP, PbRFP och TNT-RFP) kommer att inkuberas med provet som testas och fluorescens av RFP kommer att mätas. RFP kommer endast att uttryckas om lämplig kemisk analyt finns och aktiverar Promotorns region. Tre enheter som reagerar på några av de kemiska ämnen som finns i GSR har utformats och presenteras i detta arbete.

De initiativtagare som används i de tre microbocop enheter är en arsenik och antimon känsliga Promotorn, sbrfp^9,10, en ledande känslig promotor, pbrfp^11,12 och en TNT känslig promotor, TNT-RFP ¹³. eftersom en sökning i litteraturen inte visade någon promotor som var avsedd att reagera på barium valdes TNT-Promotorn istället, eftersom denna promotor är känslig för ett antal strukturellt besläktade föreningar (i synnerhet 2, 4-dinitrotoluen och dinitrobensen) som är kända för att vara en del av de organiska föreningarna kvar i GSR. Denna promotor har framgångs rikt använts för att specifikt upptäcka minut mängder TNT och 2, 4-dinitrotoluen (2, 4-DNT) i begravda landminor¹³. Med hjälp av de tre enheterna tillsammans som ett system, ett positivt test för GSR kommer att producera fluorescens i alla tre enheter. En fluorescenssignal i endast en eller två enheter kommer att indikera en annan miljö källa av analyten (s) eller i fallet med TNT Promotorn, aktivering av en förening som inte är en organisk förening kvar i GSR. Genom att använda alla tre enheterna tillsammans minimeras möjligheten till ett falskt positivt resultat på grund av miljö källor. Blyfri ammunition, som ökar i popularitet, utgör fortfarande bara cirka 5% av ammunitions försäljningen i USA; Därför kan falskt negativa resultat på grund av avsaknad av bly vara en möjlighet, men det finns fortfarande nytta i en sensor som använder bly som en markör för GSR¹⁴. Utöver denna specifika kriminal tekniska applikation kan varje enhet användas separat för att upptäcka miljö föroreningar.

De protokoll som presenteras inkluderar syntetisk biologi tekniker som används för att skapa enheter (sensor bakterier) och analys metoder för att kontrol lera funktionen av enheterna och analysera fluorescens signaler som erhållits. Protokollet innehåller också insamling av kriminal tekniska bevis i form av hand torka för att samla GSR från händerna på en misstänkt eller badda att samla GSR från en yta. Resultat från bly sensor enheten presenteras som exempel resultat, tillsammans med en demonstration av ett positivt test för GSR med hjälp av ett använt patron hölje.

Protocol

Anmärkning: syntes av E. coli som uttrycker RFP presenteras. 1. beredning av plasmid DNA från E. coli Tina e. coli innehåll Ande en Plasmid med en RFP-gen och ampicillin-resistens gen och odla e. coli på LURIA buljong (lb) agar plattor som innehåller 100 μg/ml ampicillin vid 37 ° c för 24 h. Till exempel använda J10060 Plasmid från registret av standard biologiska delar som används för syntetisk biologi (se tabell över material…

Representative Results

Fluorescenspektra för RFP-varianten som används i detta arbete visas i figur 2. Dessa data kommer från PbRFP-enheten eftersom den svarar på bly och TNT-RFP-enheten eftersom den svarar på två analyter, 2, 4-DNT och 1, 3-DNB. Denna siffra visar ett spektrum av en negativ kontroll (ingen analyten tillsätts), och spektra vid två olika nivåer av analyt tillsätts. Den maximala fluorescenssignalen för den använda RFP-varianten observerades vid 575 nm (exciteringvågl…

Discussion

Ändringar och fel sökning

Experimentet som beskrivs i tabell 4 kan på något sätt anpassas till de sensorer som har konstruerats. Den viktigaste aspekten av en kemisk sensor är att utvärdera dess känslighet och specificitet. Det är fördelaktigt att se till att en mängd olika koncentrationer av analyten analyseras för att bestämma det användbara analytiska omfånget av sensorn. Det är också värt att fastställa en maximal nivå av analyt för ce…

Materials

1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S