Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması
Summary
Bir protokol, silah kalıntıları analizi için bir dizi bakteriyel biyosensör sentezlemek ve floresan spektroskopisi kullanılarak amaçlanan kullanım için cihazların çalışmasını sınamak için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak sunulmuştur.
Abstract
Microbocop adli Kimya benzersiz bir uygulama için tasarlanmış bir biyosensör olduğunu. MicRoboCop, birlikte kullanıldığında, üç anahtar analitinin (antimon, Lead ve organik bileşenleri) varlığında floresan sinyali üreterek silah kalıntılarının (GSR) varlığını belirtebilmekte olan üç cihazdan oluşan bir sistemdir. Protokol, Escherichia coli (E. coli) kullanarak biyosensörlerin sentezini ve sensörlerin seçicilik ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılan analitik kimya yöntemlerini açıklar. Sistemin işleyişi, harcanan bir kartuş muhafazanın içinden toplanan GSR kullanılarak gösterilmiştir. Hazırlanmış bir kez, biyosensörler gerekli kadar depolanabilir ve bu anahtar analitler için bir test olarak kullanılabilir. Üç analitlerden olumlu bir yanıt, GSR için bir tahmin pozitif test sağlar, her bir cihaz diğer örneklerde analitler (örneğin, içme suyunda kurşun kontaminasyonu için bir dedektör) tespit etmek için uygulamalar vardır. Sistemin ana sınırlaması pozitif bir sinyal için gereken zamandır; gelecekteki çalışmalar, yanıt süresini optimize etmek için farklı organizmaların incelenmesi gerektirebilir.
Introduction
Bir biyosensör, bir kimyasal maddenin veya analitin tespiti için kullanılabilecek bir yanıt üreten biyolojik bileşenleri (proteinler, nüklemik asitler veya bütün organizmalar gibi) kullanan herhangi bir analitik cihazdır. Örnek olarak, kömür madencilik endüstrisi, zehirli maden gazlarının varlığını algılamak için 20. yüzyılın çoğunu bir biyosensör kullandı: kömür madeninde kanarya1. Biyoloji organizmanın (Kanarya ‘s) bir kimyasal analizine (karbon monoksit) yanıt (ölüm veya sıkıntı) işçiler korumak için madenciler tarafından gözlendi. Daha modern ve sofistike bir örnekte, bakterilerin bir floresan proteinin ifadesi gibi belirli bir yanıtı sergileme yoluyla belirli bir kimyasal analitin varlığına yanıt vermek için sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak değiştirilebilir.
Sentetik biyoloji, doğal olarak mevcut olmayan biyolojik cihazların ve sistemlerin inşası veya belirli bir amaç için mevcut biyolojik sistemlerin yeniden tasarımı anlamına gelen geniş bir terimdir2. Sentetik biyoloji, standart bir metodoloji ve cihazlar ve sistemlersentezlemek için kullanılabilecek standartlaştırılmış parçaların (Standart Sentetik Biyoloji Genetik elemanları) varlığı ile genetik mühendisliğinden ayrılır. Bir cihazıngenomuna, bir bakteri gibi bir organizmaya, fonksiyonun bir göstergesi olarak hizmet edecek belirli bir özelliği ifade etmek için bir parça tanıtılmaktadır. Örneğin, birçok sentetik cihazlarda, bir floresan proteinin ifadesi bir muhabir protein olarak tek bir hücreli organizmaya tanıtıldı. Birden çok aygıt bir sistemebirleştirilebilir. Bakteriler gibi mikroorganizmaların genomlar bu şekilde manipüle etmek kolaydır. Literatürde son on yıl içinde çok çeşitli kimyasal analitlere özgü biyosensörlerin çok sayıda örneği bildirilmiştir3,4.
Bu çalışmayla microbocop sistemi, adli ve çevresel kimyanın yeni uygulamaları ile sentetik biyoloji teknikleri kullanılarak tasarlanan bir biyosensör örneği olarak sunulmuştur. MicRoboCop üç ayrı cihazların bir sistemdir, kombine, Escherichia coli kırmızı floresan protein (RFP) bir kişinin elleriyle veya bir yüzey toplanan silah kalıntı (GSR) varlığında ifade izin verecektir. Üç cihazın her biri, GSR5‘ in bir bileşeni olarak bilinen belirli bir kimyasal analit yanıt verir. Sistemin yanıt verdiği üç analitik, I. 2, 4, 6-Trinitrotoluen (TNT) ve ilgili bileşikler, II. (kurşun iyonlarının şeklinde) ve III. antimon (Ayrıca iyonlarının şeklinde).
GSR birçok farklı kimyasal madde içerir, ancak üç genellikle GSR olarak bir kalıntı tanımlamak için kullanılan Baryum, kurşun, ve antimon5. GSR tanımlaması için standart kanıt testi, enerji Dispersif X-ışını floresans (EDX)5ile Tarama elektron MIKROSKOBU (SEM) kullanmaktır. SEM-EDX, analistlerin benzersiz morfolojisi ve GSR ‘nin Elemental bileşenlerini tanımlamasına olanak tanır. Şu anda, mevcut birkaç yaygın kullanılan ikili varsayımsal testler vardır. Son zamanlarda yayımlanan bir varsayım testi birçok Labs6mevcut olmayabilir özel ekipman iyon-mobilite spektroskopisi (IMS) kullanır. Genellikle mesafe belirlenmesi için veya mermi delikleri ve yaralar5GSR kimlik için kullanılan olsa da, kullanılabilecek bir kaç renk “Spot” testler vardır. Ayrıca, bu potansiyel alan taşınabilir olma avantajı vardır voltammetrik analiz, istihdam GSR için elektrokimyasal testler için literatürde bazı sınırlı dikkat olmuştur, ya da anodik sıyırma voltammetry, hangi bir son derece Metalik elemanlar için hassas Yöntem7. Diğer adli uygulamalar için bazı biyosensörler8yayınlandı olsa da, GSR tespit amacıyla özel olarak tasarlanmış biyosensörler literatürde çok az söz vardır.
MicRoboCop sistemindeki her cihaz için biyolojik unsurlar ve Plasmid inşaatı Şekil 1‘ de gösterilmiştir. Şekil 1B ‘deki kavisli ok, analitin varlığını etkinleştiren Organizatör bölgesini temsil eder, oval, muhabir proteininin çevirisine izin veren ribozomal bağlayıcı sitedir, RFP etiketli gri kutu kırmızı ifade eden geni Floresan protein ve kırmızı sekizgen transkripsiyon sonlandırma sitesidir. Her üç cihaz, GSR algılamak için bir sistem olarak birlikte kullanılacaktır. Belirli bir promotör (SbRFP, PbRFP ve TNT-RFP) olan her cihaz, test edilen örnek ile inkübe edilecektir ve RFP floresans ölçülecektir. RFP sadece uygun kimyasal analitik mevcutsa ve organizatör bölgeyi aktive ederse ifade edilecektir. GSR ‘de bulunan bazı kimyasal maddelere yanıt veren üç cihaz tasarlanmıştır ve bu çalışmanın içinde sunulmaktadır.
Üç mikrobocop cihazlarda kullanılan organizatör bir arsenik ve antimon duyarlı promotör, sbrfp9,10, bir kurşun duyarlı promotör, pbrfp11,12 ve bir TNT duyarlı promotör, TNT-RFP 13. çünkü literatürde bir arama Barium yanıt için tasarlanmış hiçbir Organizatör ortaya, TNT Organizatör bunun yerine seçildi bu Organizatör yapısal olarak ilgili bileşiklerin bir dizi duyarlı olduğundan (özellikle, 2, 4-dinitrotoluene ve dinitrobenzen), GSR ‘de geride kalan organik bileşiklerin bir parçası olduğu bilinmektedir. Bu Organizatör, gömülü arazi madenlerinde13dakıka miktarları TNT ve 2, 4-Dinitrotoluen (2, 4-DNT) özellikle algılamak için başarıyla kullanılmıştır. Üç cihazı bir sistem olarak birlikte kullanarak, GSR için olumlu bir test, üç cihazda da floresan üretecek. Sadece bir veya iki cihazda floresans sinyali, analitin (s) başka bir çevresel kaynağını veya TNT promotör durumunda, GSR ‘de kalan organik bir bileşik olmayan bir bileşik tarafından aktivasyonunu gösterecektir. Her üç cihazı birlikte kullanarak, çevresel kaynaklar nedeniyle yanlış olumlu sonuçlar olasılığı minimize edilir. Popülerlik kazanıyor kurşun-ücretsiz mühimmat, hala ABD ‘de mühimmat satışları sadece yaklaşık% 5 temsil eder; Bu nedenle, kurşun yokluğunda nedeniyle yanlış olumsuz sonuçlar bir olasılık olabilir ama GSR14için bir marker olarak kurşun kullanan bir sensör hala yarar vardır. Bu özel adli uygulamaya ek olarak, her cihaz çevresel kontaminantların tespit edilmesi amacıyla ayrı olarak kullanılabilir.
Sunulan protokoller, cihazların fonksiyonunu kontrol etmek ve elde edilen floresan sinyalleri analiz etmek için cihazları (sensör bakterileri) ve analitik teknikleri oluşturmak için kullanılan sentetik biyoloji tekniklerini içerir. Protokol Ayrıca, bir şüphelinin elinden GSR toplamak veya bir yüzeyden GSR toplamak için sürüntü el silme şeklinde adli kanıtlar koleksiyonunu içerir. Kurşun sensör cihazının sonuçları, harcanan kartuş muhafazasını kullanarak GSR için olumlu bir testin gösterilmesi ile birlikte örnek sonuçlar olarak sunulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Değişiklikler ve sorun giderme
Tablo 4 ‘ te açıklanan deney, tasarlanmış sensörlere uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kimyasal sensörün en önemli yönü, duyarlılık ve özgüllüğü değerlendirmektir. Sensörün kullanışlı analitik aralığını belirlemek için çok çeşitli analitik konsantrasyonlarının analiz edildiğinden emin olmak yararlıdır. Aynı zamanda hücreler için en yüksek düzeyde analit belirlemekte değer. Bu çal?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Longwood Üniversitesi ‘nde BıOL 324 (genetik) ve CHEM 403 (gelişmiş kimyasal laboratuar problemi çözme) öğrencileri, antimon ve kurşun biyosensörlerin ilk hazırlığı ve testinde yer alan öğrencileri kabul etmek ister. MicRoboCop için fikir GCAT SynBIO atölye (Yaz 2014), hangi NSF ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü tarafından finanse edilir ve Maryland Üniversitesi Baltimore County tarafından barındırılan tasarlandı. Yazarlar ayrıca Longwood Üniversitesi Cook-Cole College of Arts and Sciences ve GCAT SynBio mezunlar hibe alınan fon kabul.
Materials
| 1,3-dinitrobenzene, 97% | Aldrich | D194255-25G | |
| 2,4-dinitrotoluene, 97% | Aldrich | 101397-5G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SA450-100 | Standard in dilute HNO3 |
| Cut Smart Buffer | New England BioLabs | B7204S | |
| Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-00 | |
| EcoRI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3101S | |
| Ethanol, HPLC grade, denatured | Acros Organics | AC611050040 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits | Eurofins Genomics | SimpleSeq Kit Standard | |
| Forward primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’ | |
| Forward primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’ | |
| IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit | IBI Scientific | IB47101 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified) | Fisher Scientific | SL21-100 | Standard in dilute HNO3 |
| LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes | Hygenall | 45NRCN | Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work. |
| Methanol, HPLC grade | Fisher Scientific | A452-4 | Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work. |
| NEB 5-alpha Competent E. coli cells | New England BioLabs | C2987I | |
| NheI-HF Restriction Enzyme | New England BioLabs | R3131S | |
| Nuclease free water | New England BioLabs | B1500S | |
| OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer | New England BioLabs | M0482S | |
| Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology | Registry of Standard Biological Parts | http://parts.igem.org/Main_Page | |
| Promoter Sequences | Integrated DNA Technologies | Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’ |
|
| Reverse primer for colony PCR | Integrated DNA Technologies | 5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’ | |
| Reverse primer for DNA sequencing | Integrated DNA Technologies | 5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’ | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S |
References
- Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , (2016).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
- Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
- Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
- O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
- Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications – An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9 (2016).
- Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
- Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
- Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
- Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
- Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
- Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
- Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
- Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
- Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).
