Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn
Summary
Integrin spänning spelar viktiga roller i olika cellfunktioner. Med en integrativ spänning sensor, är integrin spänning kalibrerad med picoNewton (pN) känslighet och avbildas på submicron upplösning.
Abstract
Molekylär spänning överförs av integrin-ligand obligationer är grundläggande mekaniska signalen i integrin väg som spelar viktiga roller i många cellfunktioner och beteenden. För att kalibrera och bild integrin spänning med hög kraft känslighet och rumslig upplösning, utvecklade vi en integrativ spänningar sensorn (ITS), en DNA-baserad fluorescerande spänningar sensorn. ITS aktiveras så för att fluorescera om upprätthålla en molekylär spänning, således konvertera kraft till fluorescerande signal på molekylär nivå. Spänning tröskelvärdet för ITS aktiveringen är avstämbara i intervallet 10 – 60 pN som väl täcker det dynamiska omfånget av integrin spänningen i cellerna. På ett substrat som ympats med en ITS, är integrin spänningen av vidhäftande celler visualiseras av fluorescens och avbildas på submicron upplösning. ITS är också kompatibel med cell strukturella imaging i både live och fasta celler. ITS har tillämpats framgångsrikt till studien av trombocyter kontraktion och cellmigration. Detta papper specificerar förfarandet för syntes och tillämpningen av ITS i studien av integrin överförbara cellular kraft.
Introduction
Celler är beroende av integriner till följa och utöva cellulära styrkor till extracellulärmatrix. Integrin-medierad cell adhesion och kraft överföring är avgörande för cell spridning1,2, migration3,4och överlevnad5,6,7. På lång sikt influenser integrin biomekaniska signalering också cell spridning8,9,10 och differentiering11,12. Forskare har utvecklat olika metoder för att mäta och karta integrin överförbara cellular styrkor på cell-matrix gränssnittet. Dessa metoder bygger på elastisk underskikt13, array micropost14, eller atomic force microscopy (AFM)15,16. Elastiska underlaget och micropost metoder är beroende av deformationen av substrat att rapportera cellulär stress och har begränsningar när det gäller rumslig upplösning och tvinga känslighet. AFM har hög kraft känslighet, men den kan inte upptäcka kraft på flera ställen samtidigt, vilket gör det svårt att kartlägga cellulära kraft överförs av integriner.
Under de senaste åren utvecklades flera tekniker för att studera cellulära kraft på molekylär nivå. En samling av molekylär spänning sensorer baserat på polyetylenglykol17,18, spider silk peptid19och DNA20,21,22,23 utvecklades till visualisera och övervaka spänningar överförs av molekylära proteiner. Bland dessa tekniker antogs först DNA som syntes materialet i spänningen spårvidd tjuder (TGT), en rupturable länkare som modulerar den övre gränsen för integrin spänningar i levande celler22,24. Senare, kombinerades DNA och fluorescens resonans överföra teknik för att skapa hårnål DNA-baserade fluorescerande spänning sensorer först av Chens grupp23 och Salaitas grupp20. Hårnål DNA-baserade spänningar sensorn rapporterar integrin spänningen i realtid och har tillämpats framgångsrikt till studien av en rad cellulära funktioner21. Efteråt, kombinerat Wang’s lab en TGT med fluorophore-törstsläckare paret till rapporten integrin spänning. Denna sensor heter en ITS25,26. ITS är baserad på dubbelsträngat DNA (dsDNA) och har ett bredare dynamiskt omfång (10-60 pN) för integrin spänning kalibrering. I motsats till hårnål DNA-baserade sensorer, ITS redovisar inte cellular kraft i realtid men registrerar alla historiska integrin händelser som fotavtryck av cellulära kraft; Denna signal ackumulationsprocessen förbättrar känsligheten för cellulära kraft imaging, gör det möjligt att bilden cellular kraft även med low-end fluorescens Mikroskop. Syntesen av ITS är relativt mer praktiskt eftersom det är skapat av korsa två enkelsträngade DNAs (ssDNA).
ITS är en 18-base-parat dsDNA konjugerat med biotin, en fluorophore, en törstsläckare (svart hål törstsläckare 2 [BHQ2])27och en cyklisk arginylglycylaspartic syra (RGD) peptid28 som ett integrin peptid ligand (figur 1). Den nedersta delen är konjugerat med fluorophore (Cy3 används i detta manuskript, medan andra färgämnen, såsom Cy5 eller Alexa-serien, har också visat genomförbart i vårt labb) och biotin taggen, som ITS är orörlig på ett substrat av biotin-metoden bond. Den övre delen är konjugerat med RGD peptiden och det svarta hålet törstsläckare, som släcker Cy3 med cirka 98% släcka effektivitet26,27. Med protokollet presenteras i denna uppsats, är beläggning tätheten av ITS på ett substrat runt 1100/µm2. Detta är den täthet som vi tidigare kalibrerade för 18 bp biotinylerade dsDNA belagd på neutrAvidin-functionalized substratet genom att följa samma beläggning protokoll29. När celler följer underlaget belagd med ITS, integrin binder ITS genom RGD och överför spänning till ITS. ITS har en viss spänning tolerans (Ttol) som definieras som tröskeln spänning som mekaniskt skiljer dsDNA av ITS inom 2 s22. DESS bristning av integrin spänning leder till avskiljandet av törstsläckare från färgämnet som därefter avger fluorescens. Som ett resultat, osynliga integrin spänningen omvandlas till en fluorescens signal och den cellulära kraften kan mappas av fluorescens imaging.
För att demonstrera tillämpning av ITS, använder vi fisk keratocyte här, en allmänt använd cell modell för cell migration studie30,31,32, CHO-K1 cell, vanliga nonmotile cellinje och NIH 3T3 fibroblast. Coimaging av integrin spänning och cellen strukturer bedrivs också.
Protocol
Representative Results
Discussion
ITS är en mycket tillgänglig men ändå kraftfull teknik för cellulära tvinga kartläggning både syntes och ansökan. Med alla material redo, kan ITS syntetiseras inom 1 dag. Under experiment behövs bara tre steg av ytbeläggning före cellen plätering. Nyligen har förenklat vi ytterligare beläggning förfarandet till ett steg genom att direkt länka ITS till bovint serumalbumin, som möjliggör direkt fysiska adsorption av ITS till glas eller polystyren ytor33. ITS ger fluorescerande int…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av fondens start tillhandahålls av Iowa State University och av National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences – Series IV – Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
