工程生物膜的三维造型
Summary
本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。
Abstract
生物膜是细菌的集合体, 嵌入在自产生的空间模式的细胞外基质中。生物膜内的细菌会产生增强的抗生素耐药性, 这对健康构成潜在的危害, 但也可能有利于环境应用, 如饮用水的净化。抗菌疗法和生物膜启发应用的进一步发展将需要开发可重复的、可工程化的生物膜制造方法。近年来, 一种利用改进型三维 (3D) 打印机制备细菌油墨的生物膜的新方法。本文介绍了构建这种高效、低成本的3D 生物打印机所需的步骤, 它在细菌诱导材料加工中提供多种应用。该协议从一个经过调整的商用3D 打印机开始, 在这种打印机中, 挤出机已被连接到注射器泵系统的生物墨水分配器所取代, 从而实现了可控的、连续的生物墨水流动。为了开发一种适用于生物膜印刷的生物油墨, 工程中的大肠杆菌被悬浮在海藻酸盐溶液中, 使其与含钙表面发生凝固。在印刷基板中加入诱导剂化学品会推动生物膜蛋白在印刷生物油墨中的表达。该方法可对由印刷生物膜的离散层组成的各种空间图案进行3D 打印。这种空间控制的生物膜可以作为模型系统, 并可以在对社会产生广泛影响的多个领域找到应用, 包括抗生素耐药性预防或饮用水净化等。
Introduction
由于空间图案材料的市场不断增加, 目前越来越需要开发环保、可持续的空间图案材料生产解决方案1。本文介绍了一种简单、经济的生产此类材料的方法, 因此提供了大量的未来应用。这里介绍的方法允许使用含有活细菌的生物油墨对空间图案结构进行三维 (3D) 打印。细菌在印刷结构中保持一周以上的活力, 使细菌能够进行自然或工程的代谢活动。因此, 印刷细菌可以在印刷结构中产生和沉积所需的成分, 例如创建一个功能交联生物膜2。
生产先进材料的传统方法涉及高能源支出 (如高温和高压), 并可能产生大量化学废物, 往往是需要成本广泛使用的有毒物质 3 ,4。相比之下, 多种细菌物种能够生产出容易适用于各种行业的材料。这些材料包括聚合物, 如聚羟基烷酸盐 (pha)5或聚 (乙二醇-异丙基)(pgla) 6, 细菌纤维素7, 细菌混凝土材料8, 仿生复合材料9,淀粉基胶粘剂10台, 或生物基电气开关 11, 等等。此外, 有价值材料的细菌生产通常在接近环境温度和压力的环境中, 在水环境中进行, 不需要或不产生有毒化合物。虽然用细菌生产材料已在文献中得到证明, 一些工业应用已经出现了12、13,但这种材料的空间模式的可靠方法仍然是一项挑战。
本文演示了一种将低成本商用3d 打印机转换为3D 细菌打印机的直接方法。该协议展示了如何制备含有和维持活细菌的生物油墨, 以及如何制备可以进行3D 打印的基板。这种方法适用于能够产生材料的各种天然和工程细菌株。这些细菌可以在三维打印结构中进行空间分布, 并继续其代谢活动, 这将导致细菌产生的所需材料的空间分布。
这种印刷方法使生物膜的添加剂制造, 细菌的聚集被一个自我产生的细胞外基质包围。生物膜是异质的3D 网络, 其中蛋白质、聚合物、细菌细胞、氧气和营养物质都是空间结构的 14。而以生物膜的形式, 细菌表现出更强的抗生素耐药性和结构鲁棒性, 使其难以从包括医疗导管和植入物在内的表面中根除。生物膜特性的关键, 也是生物膜研究面临的最大挑战, 似乎是生物膜15、16、17的异质性。空间控制模型生物膜的生产特别令人感兴趣, 因为它将允许复制或调整生物膜组件的空间模式, 有助于了解生物膜在几乎任何表面上的稳定沉积。自然。
本文介绍了一种使用3d 打印的含有工程大肠杆菌的水凝胶生产生物膜的方法, 这些水凝胶在感应器存在的情况下产生生物膜蛋白, 以及生物膜形成的验证方法2.这些生物膜的细胞外基质成分是含有自组装 CsgA 蛋白的 curli 淀粉样纤维 18.当工程中的大肠杆菌被诱导表达 csga 蛋白时, 它们形成一个稳定的生物膜模型, 保护细胞免受从印刷表面被冲走的影响。这种三维印刷生物膜可以在空间上进行控制, 可以作为研究多尺度生物膜结构-功能力学或材料组学的有用研究工具19。这些定制的生物膜将有助于了解生物膜形成的原理及其机械性能, 从而能够进一步研究抗生素耐药的机制等应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的工程生物膜3D 打印协议有两个关键步骤。首先是琼脂印刷表面的制备, 这是产生特定印刷分辨率的最关键因素。重要的是要确保打印表面是平的, 并且打印头上的移液器尖端位于表面的正确高度。如果表面不平整, 则在打印过程中工作距离会发生变化。如果工作距离小于 0.1 mm, Ccl2溶液可能进入移液器尖端内, 导致水凝胶形成, 导致移液器尖端堵塞。如果工作距离超过 0.3 mm, 则无法…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 AOARD 赠款的支持 (没有。FA2386-18-1-4059), 荷兰科学研究组织 (NWO/OCW), 作为纳米科学前沿方案和先进材料 NWO-NSFC 方案 (729.001.016) 的一部分。作者承认 Ramon van der Valk 和 Roland Kieffer 的实验室援助。
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
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