Трехмерная паттерна инженерных биопленок с сделай-сам Биопринтер
Summary
В этой статье описывается метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в бактериальный 3D-принтер, который может облегчить печать узорчатых биопленок. Описаны все необходимые аспекты подготовки биопроинтера и био-чернил, а также методы верификации для оценки формирования биопленок.
Abstract
Биопленки представляют собой агрегаты бактерий, встроенных в самопроизводно-узорный внеклеточный матрикс. Бактерии внутри биопленки развивают повышенную устойчивость к антибиотикам, которая создает потенциальную опасность для здоровья, но также может быть полезной для экологических применений, таких как очистка питьевой воды. Дальнейшее развитие антибактериальных терапевтических и биопленки-вдохновил приложений потребует разработки воспроизводимых, инженерный методы для создания биопленки. Недавно был разработан новый метод приготовления биопленки с использованием модифицированного трёхмерного (3D) принтера с бактериальной краской. В этой статье описываются шаги, необходимые для создания этой эффективной, недорогой 3D биофинтер, который предлагает несколько применений в бактериально-индуцированной обработки материалов. Протокол начинается с адаптированного коммерческого 3D принтера, в котором экструдер был заменен на био-чернила распылитель подключен к системе шприца насос позволяет управляемый, непрерывный поток био-чернил. Для разработки био-чернил подходит для биопленки печати, инженерии кишечной палочки бактерии были приостановлены в растворе альгината, так что они затвердевают в контакте с поверхностью, содержащей кальций. Включение индуктор химического вещества в печать субстрата диски выражения биопленки белков в печатных био-чернил. Этот метод позволяет 3D печать различных пространственных паттернов, состоящих из дискретных слоев печатных биопленок. Такие территориально контролируемые биопленки могут служить в качестве модельных систем и могут находить применение в различных областях, которые оказывают широкомасштабное воздействие на общество, включая профилактику устойчивости к антибиотикам или очистку питьевой воды, в частности.
Introduction
В настоящее время растет потребность в разработке экологически чистых, устойчивых решений для производства материалов с территориально-узором, в связи с расширением числа рынков для таких материалов1. Эта статья представляет простой, экономичный метод для производства таких материалов и, следовательно, предлагает широкий спектр будущих приложений. Представленный здесь метод позволяет трехмерную (3D) печать пространно-узорных конструкций с использованием био-чернил, содержащей живые бактерии. Бактерии остаются жизнеспособными в печатных структурах в течение более одной недели, что позволяет бактериям выполнять естественные или инженерные метаболические действия. Печатные бактерии могут тем самым производить и депозит желаемых компонентов в рамках печатной структуры, например, создание функциональных кросс-связанной биопленки2.
Традиционные методы производства передовых материалов связаны с высокими энергетическими расходами (например, высокими температурами и/или давлением) и могут производить большое количество химических отходов, часто токсичных веществ, которые требуют широкого использования с высокой стоимостью3 ,4. В отличие от этого, несколько бактериальных видов способны производить материалы, которые могут быть легко применимы в различных отраслях промышленности. К ним относятся полимеры, такие как полигидрокяльканоаты (ГФА)5 или поли (гликолиде-Co-lactide) (плгла)6, Бактериальная целлюлоза7, бактериальные бетонные материалы8, Биомиметические композиты9, Амилоид основе клеи10, или био основе электрических переключателей11, среди других. Кроме того, бактериальное производство ценных материалов, как правило, происходит при близкой температуре и давлении и в окружающих средах, без необходимости или производства токсичных соединений. В то время как производство материалов с бактериями было продемонстрировано в литературе и некоторые промышленные приложения уже появились12,13, надежный метод для пространственного паттерна таких материалов остается проблемой.
Эта статья демонстрирует прямой метод превращения недорогого коммерческого 3D-принтера в 3D-бактериальный принтер. Протокол показывает, как подготовить био-чернила, содержащие и поддержания живых бактерий, а также как подготовить субстраты, на которых 3D печать может быть выполнена. Этот метод подходит для использования с различными природными и инженерии бактериальных штаммов, способных производить материалы. Эти бактерии могут быть территориально распределены в 3D печатной структуры и по-прежнему продолжать свою метаболическую активность, что приведет к пространственному распределению желаемых материалов, производимых бактериями.
Этот метод печати позволяет аддитивное производство биопленок, агрегатов бактерий, окруженных самодпроизводной внеклеточной матрицей. Биопленки являются неоднородными 3D-сетями, в которых белки, полимеры, бактериальные клетки, кислород и питательные вещества являются территориально структурированными14. В виде биопленки бактерии проявляют повышенную устойчивость к антибиотикам и структурную устойчивость, что затрудняет их ликвидацию на поверхностях, включая медицинские катетеры и имплантаты. Ключом к свойствам биопленки, а также крупнейший вызов биопленки исследования, кажется, гетерогенность биопленок15,16,17. Особый интерес представляет производство биопленок, контролируемых в рамках территориально-пространственной модели, поскольку это позволит либо воспроизводить, либо настраивать пространственные структуры компонентов биопленки, способствуя пониманию стабильного осаждения биопленок практически на любой поверхности в Природа.
Эта статья представляет собой метод для производства биопленок с использованием 3D-печатных гидрогелей, содержащих модифицированные бактерии E. coli , которые производят протеины биопленки в присутствии индуктор, а также методы верификации формирования биопленки2 . Основные внеклеточные матрицы компоненты этих биопленок являются curli амилоидных волокон18 , которые содержат самособранном CGA белков. При инженерии E. coli бактерии индуцируется, чтобы выразить белки КПГА, они образуют стабильную модель биопленки, которая защищает клетки от смывается поверхности печати. Такая трехмерная биопленка может быть территориально контролируемой и может послужить полезным исследовательским инструментом для исследования структуры многомасштабной биопленки-механики функций или материаломики19. Эти индивидуальные биопленки помогут пониманию принципов формирования биопленки и их механических свойств, что позволит дополнительно исследовать механизмы устойчивости к антибиотикам среди других применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, представленный здесь для 3D-печати инженерных биопленок, имеет два критических шага. Во-первых, является подготовка поверхности агаровой печати, которая является наиболее важным фактором для производства конкретного разрешения печати. Важно обеспечить, чтобы поверхность печ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом АОАР (No. FA2386-18-1-4059), Нидерландская организация научных исследований (НВО/OCW) в рамках программы “границы нанонауки” и программы “передовые материалы NWO-НФК” (No 729.001.016). Авторы признают лабораторную помощь Рамона ван дер валка и Роланда Киффер.
Materials
| 3D printer | CoLiDo | 3D-P Kit | |
| 3D printing software | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Orbital shaker | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| Petri dish | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Silicon tubing | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Syringe pump | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Sodium alginate | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Sodium citrate monobasic | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Sodium hydrooxide | VWR | 28244.295 |
References
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
