Electroretinogram optagelse i larve zebrafisk ved hjælp af en roman kegle-formede svamp-tip elektrode

Summary

Vi præsenterer her, en protokol, der forenkler måling af lys evoked electroretinogram svar fra larve zebrafisk. En roman kegle-formede svamp-tip elektrode kan bidrage til at gøre studiet af visuelle udvikling i larve zebrafisk bruger electroretinogram ERG lettere at opnå med pålidelige resultater og lavere omkostninger.

Abstract

Zebrafisk (Danio rerio) er almindeligt anvendt som en hvirveldyr model i udviklingsmæssige undersøgelser og er især velegnet til visuelle neurovidenskab. For funktionelle målinger af visuel ydeevne er electroretinography (ERG) en ideel non-invasiv metode, som har været veletablerede i højere vertebrater. Denne tilgang er i stigende grad anvendes til at undersøge den visuelle funktion i zebrafisk, herunder under den tidlige larve udviklingsstadier. Den hyppigst anvendte optagelse elektrode til larve zebrafisk ERG til dato er imidlertid glas mikropipette elektrode, som kræver specialudstyr til dens fremstilling, præsentere en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer. Her præsenterer vi en larve zebrafisk ERG protokollen ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip elektrode. Roman elektroden er lettere at fremstilling og håndtag, mere økonomisk og mindre tilbøjelige til at skade larve øjet end glas mikropipette. Ligesom tidligere udgivne ERG ‘s metoder, kan den nuværende protokol vurdere ydre retinal funktion gennem fotoreceptor og bipolar celle svar, a – og b-bølgen, henholdsvis. Protokollen kan klart illustrere forfinelse af visuelle funktion i hele den tidlige udvikling af zebrafisk larver, støtte til nytte, følsomhed og pålidelighed af de nye elektrode. Den forenklede elektrode er især nyttig, når oprettelse af en ny ERG system eller ændre eksisterende små-dyrs ERG apparater til måling af zebrafisk, medvirken forskere i de visuelle neurovidenskab bruge zebrafisk model organisme.

Introduction

Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en udbredt genetiske hvirveldyr model, herunder undersøgelser af de visuelle neurovidenskab. Den stigende popularitet af denne art kan tilskrives fordele, herunder brugervenlighed genmanipulation, stærkt bevarede hvirveldyr visuelle system (neuron typer, anatomiske morfologi og organisation og underliggende genetik), høj frugtbarhed og lavere udgifter til dyrehold i forhold til pattedyr modeller¹. Den ikke-invasiv electroretinogram (ERG) har længe været anvendt klinisk til at vurdere menneskets visuelle funktion, og i laboratoriet indstilling til at kvantificere vision i en række store og små arter herunder gnavere og larver zebrafisk^{2,3 , 4 , 5}. de oftest analyseres ERG komponenter er en bølge og b-bølge, stammer fra den oplyse-sensing fotoreceptorer og bipolær interneurons, henholdsvis. I larver zebrafisk, adskilte lag i nethinden er etableret af 3 dage efter befrugtningen (dpf) og morfologi af fotoreceptor kegle terminal synapser modne før 4 dpf^6,7. Ydre retinal funktion af larve zebrafisk er således etableret før 4 dpf, hvilket betyder, at ERG er målelige fra denne tidlige alder og fremefter. På grund af den korte eksperimentelle cyklus og høj overførselshastighed egenskaber af modellen, har ERG udlignet larve zebrafisk for funktionel vurdering af sygdomsmodeller, analysere farve vision og retinal udvikling, studere visuelle døgnrytmen og test narkotika^8,9,10,11,12.

Men nuværende strategier for larver zebrafisk ERG har nogle kompleksiteter, som kan gøre det sværere at vedtage. Offentliggjorte larve zebrafisk ERG protokoller bruger normalt en glas mikropipette fyldt med ledende væske som den optagelse elektrode^3,4,5,13, der kræver en høj kvalitet mikropipette Tip³. Specialiseret udstyr, såsom en mikropipette aftrækker og i nogle tilfælde en microforge, der kræves til deres fremstilling. Dette kan være en udfordring for laboratorier med begrænsede ressourcer og medfører ekstra omkostninger selv når tilpasning tilgængelige små dyr ERG systemer til måling af larve zebrafisk visuel funktion. Selv når glattede, kan skarpe mikropipette tip beskadige larve øjets overflade. Derudover er kommercielle mikropipette holdere til Elektrofysiologi konstrueret med en fast sølvtråd. Disse faste ledninger blive passivated efter gentagen brug, som kræver køb af nye indehavere fører til øgede vedligeholdelsesudgifter.

Her beskriver vi et ERG-metoden ved hjælp af en kegle-formede svamp-tip optagelse elektrode, der er særligt nyttig for at tilpasse etablerede små-dyrs ERG opsætninger for larver zebrafisk ERG målinger. Elektroden er let lavet ved hjælp af fælles polyvinylacetat (PVA) svamp og fine sølvtråd uden nogen andre specialiseret udstyr. Vores data viser, at denne roman elektrode er følsomme og pålidelige nok til at påvise funktionelle udviklingen af retinale neurale kredsløb i larve zebrafisk mellem 4 og 7 dpf. Denne økonomisk og praktisk svamp-tip elektrode kan være nyttigt at forskere om oprettelse af nye ERG systemer eller ændre eksisterende små-animalsk systemer, for zebrafisk undersøgelser.

Protocol

Alle electroretinogram (ERG), der blev udført efter bestemmelserne i den australske National sundhed og Medical Research Council adfærdskodeks for pasning og brug af dyr og blev godkendt af den institutionelle Dyreetik på den University of Melbourne. 1. buffer forberedelse Forberede 10 x guldfisk ringelyden bufferen (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukose, 100 mM HEPES) ved hjælp af omvendt osmose (RO) vand. Justere buffer til pH 7,…

Representative Results

Dette afsnit indeholder repræsentative resultater for ERG målinger taget dagligt fra 4 til 7 dpf. Fra 4 dpf Vis ERG ‘s svar robust a – og b-bølge komponenter, som opstår fra fotoreceptorer og bipolar celler, henholdsvis. I hver alder testet, b-bølge amplitude steg med lysintensiteten (figur 2; Figur 3). Navnlig, følsomheden af larve zebrafisk nethinden til lysdæmper blinker øges med alderen. A – og b-bølgen var ikke genkendelige ved …

Discussion

Funktionelle udlæsninger som ERG er blevet stadig vigtigere i suite af værktøjer, der anvendes til at studere larve zebrafisk^8,9,12,14. På grund af den lille størrelse af larve zebrafisk øjet er glas Mikropipetter blevet tilpasset som optagelse elektroder i mest publicerede protokoller^3,4,5,…

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings