Électrorétinogramme enregistrement chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide d’électrode de pointe éponge en forme de cône de roman A
Summary
Nous présentons ici un protocole qui simplifie la mesure de lumière électrorétinogramme évoqués réponses des larve zebrafish. Une électrode roman éponge-pointe conique peut aider à rendre l’étude du développement visuel chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide de l’électrorétinogramme ERG plus facile à réaliser avec des résultats fiables et à moindre coût.
Abstract
Le poisson zèbre (Danio rerio) est couramment utilisé comme un modèle de vertébrés dans les études sur le développement et est particulièrement adapté pour la neuroscience visuelle. Pour les mesures fonctionnelles de performance visuelle, électrorétinographie (ERG) est une méthode non invasive idéale, qui a été bien établie dans les espèces de vertébrés supérieurs. Cette approche est plus en plus utilisée pour l’examen de la fonction visuelle chez le poisson zèbre, y compris pendant les premiers stades du développement larvaires. Toutefois, l’électrode d’enregistrement plus couramment utilisés pour les larve zebrafish ERG à ce jour est l’électrode de verre micropipette, qui nécessite un équipement spécialisé pour sa fabrication, présentent un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées. Nous présentons ici un protocole ERG de larves de poisson zèbre à l’aide d’une électrode embout éponge en forme de cône. La nouvelle électrode est plus facile de fabriquer poignée, plus économique et moins susceptible d’endommager l’oeil larvaire que la micropipette de verre. Comme méthodes ERG publiées antérieurement, le protocole actuel peut évaluer la fonction rétinienne externe par le biais de photorécepteur et réponses des cellules bipolaires, l’a – et b-vague, respectivement. Le protocole peut illustrent clairement le raffinement de la fonction visuelle au cours du développement précoce des larves de poisson zèbre, soutenant l’utilitaire, sensibilité et fiabilité de l’électrode de roman. L’électrode simplifiée est particulièrement utile lorsque établissant un nouveau système ERG ou modifier l’existant appareils d’ERG de petits animaux pour mesure de poisson-zèbre, aider des chercheurs en neurosciences visuels à utiliser le poisson-zèbre modèle organisme.
Introduction
Le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un modèle génétique de vertébrés largement utilisé, y compris des études de neurosciences visuels. La popularité croissante de cette espèce peut être attribuée aux avantages dont la facilité de manipulation génétique, hautement conservée vertébré système visuel (types de neurones, la morphologie anatomique et organisation et génétique sous-jacente), forte fécondité et pour un coût de gestion des ressources par rapport aux modèles mammifères1. La non invasif électrorétinogramme (ERG) a longtemps été utilisé sur le plan clinique pour évaluer la fonction visuelle humaine et en laboratoire afin de quantifier la vision dans un éventail d’espèces grandes et petites, y compris les rongeurs et les larves de poisson zèbre2,3 , 4 , 5. les composants ERG plus couramment analysés sont l’une onde et ondes b, originaires de la détection de lumière les photorécepteurs et les interneurones bipolaires, respectivement. Chez le poisson zèbre larvaire, couches distinctes dans la rétine sont établis par la fertilisation après 3 jours (dpf) et la morphologie du cône terminal photorécepteur synapses matures avant 4 dpf6,7. La fonction rétinienne externe du poisson-zèbre larvaire est donc établie avant dpf 4, ce qui signifie que l’ERG est mesurable à partir de cet âge précoce à partir. En raison du cycle court expérimental et les propriétés haut débit du modèle, l’ERG a été appliqué aux larve zebrafish pour évaluation fonctionnelle des modèles de maladies, analyse de vision et la rétine de coloration, l’étude des rythmes circadiens visuels et essai de drogue8,9,10,11,12.
Toutefois, les approches actuelles pour le poisson-zèbre larvaire ERG a certaines complexités qui peuvent rendre plus difficile à adopter. Publié zebrafish larvaire ERG protocoles utilisent généralement une micropipette de verre remplie de liquide conducteur sous l’enregistrement électrode3,4,5,13, qui exige une micropipette de haute qualité Astuce3. Équipement spécialisé, comme un de micropipettes et dans certains cas, une microforge, sont nécessaires à leur fabrication. Cela peut être un défi pour les laboratoires disposant de ressources limitées et entraîne des coûts supplémentaires même lors de l’adaptation des systèmes ERG animaux petits disponibles pour la mesure de la fonction visuelle de larves de poisson zèbre. Même lorsque le lissé, le bout pointu micropipette pouvant endommager la surface de le œil larvaire. En outre, titulaires d’une micropipette commerciale pour l’électrophysiologie sont construits avec un fil d’argent fixe. Ces fixes fils devient passivés après utilisation répétitive, nécessitant l’achat des nouveaux titulaires, entraînant des coûts de maintenance accrus.
Nous décrivons ici une méthode ERG à l’aide d’une électrode d’enregistrement pointe éponge en forme de cône, qui est particulièrement utile pour l’adaptation des configurations d’ERG petits animaux établies pour les larves de poisson zèbre ERG mesures. L’électrode est facilement fait à l’aide de la commune éponge d’acétate de polyvinyle (PVA) et fil d’argent fin sans n’importe quel autre équipement spécialisé. Nos données montrent que cette nouvelle électrode est sensible et assez fiable pour démontrer le développement fonctionnel des circuits neuraux rétiniennes en larve zebrafish entre 4 et 7 dpf. Cette électrode embout éponge économique et pratique peut être utile pour les chercheurs en établissant de nouveaux systèmes ERG ou de modifier les systèmes existants de petits animaux, d’études de poisson-zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Affichages fonctionnels tels que l’ERG ont pris une important croissante à la suite d’outils utilisés pour l’étude des larves de poisson zèbre8,9,12,14. En raison de l’exiguïté de le œil de larves de poisson zèbre, micropipettes de verre ont été adaptées comme l’enregistrement des électrodes en plus publiées protocoles3,<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par une subvention de l’Institut de neurosciences de Melbourne (pour PTG, PRJ & BVB).
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
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