Elektroretinogramm Aufnahme im Larvenstadium Zebrafisch mit A Roman kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode

Summary

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die die Messung von Licht evozierten Elektroretinogramm Antworten von Larven Zebrafisch vereinfacht. Eine neuartige kegelförmige Schwamm-Tip Elektrode kann dazu beitragen, das Studium der visuellen Entwicklung im Larvenstadium Zebrafisch mit Elektroretinogramm ERG mit einfacher zuverlässige Ergebnisse und geringere Kosten.

Abstract

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) wird allgemein als ein Wirbeltier Modell in Studien verwendet und eignet sich besonders für visuelle Neurowissenschaften. Für Funktionsmessungen der Sehleistung ist Zitterrochens (ERG) eine ideale nicht-invasive Methode, die in höheren Wirbeltierarten bestens etabliert hat. Dieser Ansatz wird zunehmend eingesetzt, für die Prüfung der Sehfunktion im Zebrafisch, auch während der frühen Entwicklungen Larvenstadien. Allerdings ist die am häufigsten verwendeten Aufnahme-Elektrode für Larven Zebrafisch ERG bisher Mikropipette Glaselektrode, die speziellen Ausrüstung für seine Herstellung, stellen eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen erfordert. Hier präsentieren wir Ihnen ein Larven Zebrafisch-ERG-Protokoll mit einer kegelförmigen Schwamm-Tip Elektrode. Die neuartige Elektrode ist einfacher zu Herstellung und Griff, sparsamer und weniger anfällig für die Larven Auge als das Glas Mikropipette schädigen. Wie zuvor veröffentlichten ERG Methoden kann das aktuelle Protokoll äußere retinale Funktion durch Photorezeptor und bipolar-Zell-Antworten, die a – und b-Welle, bzw. bewerten. Das Protokoll kann die Verfeinerung der visuellen Funktion während der frühen Entwicklung von Zebrafischlarven, Unterstützung der Dienstprogramm, Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der neuartige Elektrode verdeutlichen. Die vereinfachte Elektrode ist besonders nützlich bei der Errichtung eines neuen ERG oder ändern von bestehenden kleinen Tier ERG Vorrichtung zum Zebrafisch-Messung, Beihilfe Forscher in den visuellen Neurowissenschaften der Zebrabärbling verwenden Modell Organismus.

Introduction

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) ist eine verbreitete genetische vertebrate Modell, einschließlich Studien der visuellen Neurowissenschaften geworden. Die zunehmende Beliebtheit dieser Spezies kann Vorteile einschließlich einfache Genmanipulation, hoch konservierte vertebrate visuelle System (Neuron Typen, anatomischen Morphologie und Organisation sowie zugrunde liegende Genetik), hohe Fruchtbarkeit zugeschrieben werden und geringere Kosten für die Tierhaltung im Vergleich zu Säugetieren Modelle¹. Die nicht-invasive Elektroretinogramm (ERG) ist seit langem verwendet klinisch menschlichen visuellen Funktion zu beurteilen und in der Laborumgebung zu quantifizieren, Vision in einer Reihe von großen und kleinen Arten, darunter Nagetiere und Larven Zebrafisch^{2,3 , 4 , 5}. der am häufigsten untersuchten ERG Komponenten sind die a-Welle und b-Welle, mit Ursprung aus dem lichtempfindlichen Photorezeptoren und bipolar Interneuronen, beziehungsweise. Im Larvenstadium Zebrafisch unterschiedliche Schichten in der Netzhaut werden durch 3 Tage nach Befruchtung (Dpf) festgelegt und die Morphologie des Kegels Photorezeptor terminal Synapsen Reife vor 4 Dpf^6,7. Damit ist äußere retinale Funktion des larvalen Zebrafisch festgelegt vor 4 Dpf, was bedeutet, dass die ERG von diesem frühen Alter ab messbar ist. Wegen der kurzen experimentellen Zyklus und Hochdurchsatz-Eigenschaften des Modells ist die ERG an Larven Zebrafisch für funktionelle Beurteilung der Krankheitsmodelle, angewendet worden Analyse Vision und Retinal Farbentwicklung, Studium der visuellen zirkadianen Rhythmen und^8,9,10,11,12Drogen testen.

Aktuelle Ansätze für Larven Zebrafisch ERG hat jedoch einige Schwierigkeiten, die es erschweren können, anzunehmen. Veröffentlichten Larven Zebrafisch ERG Protokolle verwenden häufig ein Glas Mikropipette mit leitfähigen Flüssigkeit gefüllt, wie die Aufnahme Elektrode^3,4,5,13, wonach eine hochwertige Mikropipette Tipp³. Spezielle Ausrüstung, wie z. B. einer Mikropipette Puller und in einigen Fällen ein Microforge, sind für ihre Herstellung benötigt. Dies kann eine Herausforderung für Labore mit begrenzten Ressourcen und führt zu Mehrkosten, auch bei der Anpassung zur Verfügung kleine Tier ERG Systeme zur Messung von Larven Zebrafisch Sehfunktion. Auch wenn geglättet, kann die scharfe Mikropipette Spitze Larven Augenoberfläche beschädigen. Darüber hinaus sind kommerzielle Mikropipette Halterungen für Elektrophysiologie mit einer festen Silberdraht gebaut. Diese festen Drähten werden sich wiederholende Nachgebrauch, erfordert den Kauf von neuen Inhaber führt zu erhöhten Instandhaltungskosten passiviert.

Hier beschreiben wir eine ERG-Methode mit einer kegelförmigen Schwamm-Spitze Aufzeichnung Elektrode, das ist besonders nützlich für die Anpassung der etablierten kleinen Tier ERG Setups für Larven Zebrafisch ERG Messungen. Die Elektrode ist leicht gemacht mit gemeinsamen Polyvinylacetat (PVA) Schwamm und feinem Silberdraht ohne spezielle Ausrüstung. Unsere Daten zeigen, dass diese neuartige Elektrode empfindlich und zuverlässig genug, um die funktionelle Entwicklung des retinalen neuronale Schaltkreise im Larvenstadium Zebrafisch zwischen 4 und 7 Dpf zu demonstrieren. Diese wirtschaftliche und praktische Schwamm-Tip Elektrode kann Forscher zur Gründung neuer ERG Systeme oder ändern von bestehenden kleinen Tier-Systeme für Zebrafisch Studien sinnvoll sein.

Protocol

Alle Elektroretinogramm (ERG) Verfahren gemäß den Bestimmungen der australischen National Health and Medical Research Council Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt wurden und institutionellen Tierethik zu vom Ausschuss angenommen wurden die Universität von Melbourne. 1. Puffer Vorbereitung Bereiten Sie die 10 x Goldfisch Ringer Puffer (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 10 mM MgCl2, 25 mm CaCl2100 mM Glukose, 100 mM HEPES) mit Umkehros…

Representative Results

Dieser Abschnitt enthält repräsentative Ergebnisse für ERG Messungen täglich von 4 auf 7 Dpf. ERG Antworten anzeigen von 4 Dpf robuste a – und b-Welle-Komponenten, die jeweils aus Photorezeptoren und bipolaren Zellen entstehen. In jedem Alter getestet erhöht die Amplitude der b-Welle mit Lichtintensität (Abbildung 2; Abbildung 3). Vor allem die Empfindlichkeit der Netzhaut Larven Zebrafisch, dimmer Blitze mit zunehmendem Alter erhöht. …

Discussion

Funktionale anzeigen wie die ERG haben in die Suite von Tools zur Untersuchung Larven Zebrafisch^8,9,12,14immer wichtiger geworden. Aufgrund der geringen Größe des larvalen Zebrafisch Auges haben Glas Mikropipetten angepasst, als Aufnahme Elektroden in den veröffentlichten Protokollen^{3,4,5,</sup…}

Materials

0.22 µm filter	Millex GP	SLGP033RS	Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio
1-mL syringe	Terumo	DVR-5175	With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.
30G × ½" needle	Terumo	NN*3013R	For adding saline toteh sopnge tip electrode.
Bioamplifier	ADInstruments	ML135	For amplifying ERG signals.
Bleach solution	King White	9333441000973	For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.
Circulation water bath	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Used to make the water-heated platfrom.
Electrode lead	Grass Telefactor	F-E2-30	Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.
Faraday Cage	Photometric Solution International		For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.
Ganzfeld Bowl	Photometric Solution International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.
Luxeon LEDs	Phillips Light Co.		For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.
Micromanipulator	Harvard Apparatus	BS4 50-2625	Holds the recording electrode during experiments.
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Spreadsheet software for data analysis.
Moisturizing eye gel	GenTeal Gel	9319099315560	Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.
Pasteur pipette	Copan	200C	Used to caredully transfer larval zebrafish.
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML785	Controls the LEDs to generate stimuli.
PVA sponge	MeiCheLe	R-1675	For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti
Saline solution	Aaxis Pacific	13317002	For electroplating silver wire electrode.
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire)	A&E metal	0.3 mm	Used to make recording and reference ERG electrodes.
Stereo microscope	Leica	M80	Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.
Tricaine	Sigma-aldrich	E10521-50G	For anaethetizing larval zebrafish.
Water-heated platform	custom-made		For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings