Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell’elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l’elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.
Abstract
Il danio zebrato (Danio rerio) è comunemente usato come un modello di vertebrati in studi evolutivi ed è particolarmente adatto per le neuroscienze visual. Per misure funzionali di prestazioni visive, l’elettroretinografia (ERG) è un metodo non invasivo ideale, che è stato affermato in specie di vertebrati superiori. Questo approccio è sempre più utilizzato per l’esame della funzione visiva in zebrafish, inclusi durante le prime fasi dello sviluppo larvale. Tuttavia, l’elettrodo di registrazione più comunemente usati per zebrafish larvale ERG fino ad oggi è l’elettrodo di una micropipetta di vetro, che richiede attrezzature specializzate per la sua fabbricazione, che presenta una sfida per i laboratori con risorse limitate. Qui, presentiamo un protocollo ERG larvale zebrafish utilizzando un elettrodo di spugna-punta a forma di cono. Il romanzo dell’elettrodo è più facile fabbricazione e maniglia, più economico e meno probabilità di danneggiare l’occhio larvale rispetto la micropipetta di vetro. Come metodi ERG precedentemente pubblicati, l’attuale protocollo è in grado di valutare la funzione retinica esterna attraverso dei fotorecettori e risposte delle cellule bipolari, l’a – e b-onda, rispettivamente. Il protocollo può illustrare chiaramente la raffinatezza della funzione visiva in tutto lo sviluppo iniziale delle larve di zebrafish, sostenendo l’utilità, la sensibilità e l’affidabilità dell’elettrodo romanzo. L’elettrodo semplificata è particolarmente utile quando organismo di modello che istituisce un nuovo sistema ERG o modifica esistente apparato ERG di piccoli animali per la misura di zebrafish, aiutando i ricercatori nelle neuroscienze visual utilizzare zebrafish.
Introduction
Il danio zebrato (Danio rerio) è diventato un ampiamente usato modello genetico di vertebrati, compreso gli studi di neuroscienze visual. La crescente popolarità di questa specie può essere attribuita ai vantaggi tra cui la facilità di manipolazione genetica, il sistema visual vertebrati altamente conservato (tipi di neurone, morfologia anatomica e organizzazione e genetica sottostante), alta fecondità e ridurre il costo di allevamento rispetto a modelli mammiferi1. Non invasivo elettroretinogramma (ERG) lungo è stato utilizzato clinicamente per valutare la funzione visiva umana e in ambito di laboratorio per quantificare la visione in una gamma di specie piccole e grandi, tra cui roditori e larvale zebrafish2,3 , 4 , 5. i componenti ERG più comunemente analizzati sono la a onda e b-fluttua, proveniente dalla luce-sensing fotorecettori e bipolare interneuroni, rispettivamente. In zebrafish larvale, strati distinti nella retina sono stabiliti dalla post-fecondazione 3 giorni (dpf) e la morfologia del cono fotorecettore terminale sinapsi maturo prima 4 dpf6,7. Funzione esterna della retina di zebrafish larvale è così stabilita prima 4 dpf, significato che l’ERG è misurabile da questa tenera età in poi. A causa del breve ciclo sperimentale e le proprietà di alto-rendimento del modello, l’ERG è stato applicato a larvale zebrafish per valutazione funzionale dei modelli di malattia, analizzando lo sviluppo di colore, visione e retinico, studiando i ritmi circadiani visual e test farmaci8,9,10,11,12.
Tuttavia, approcci attuali per zebrafish larvale ERG ha alcune complessità che possono rendere più difficile ad adottare. Zebrafish larvale pubblicate ERG protocolli comunemente utilizzano una micropipetta di vetro riempita con liquido conduttivo come la registrazione dell’elettrodo3,4,5,13, che richiede una micropipetta di alta qualità Suggerimento3. Attrezzature specializzate, come ad esempio un estrattore micropipetta e in alcuni casi una microforge, sono necessari per la loro fabbricazione. Questo può essere una sfida per i laboratori con risorse limitate e conduce a un costo aggiuntivo anche quando adattamento disponibili sistemi per ERG piccoli animali per la misurazione della funzione visiva zebrafish larvale. Anche quando levigata, la punta della micropipetta taglienti possa danneggiare la superficie dell’occhio larvale. Inoltre, i titolari delle imprese micropipetta per elettrofisiologia sono costruiti con un filo d’argento fisso. Questi fissi fili diventano passivati dopo uso ripetitivo, che richiede l’acquisto di nuovi supporti di costi di manutenzione maggiore.
Qui descriviamo un metodo ERG utilizzando un elettrodo di registrazione di spugna-punta a forma di cono, che è particolarmente utile per l’adeguamento stabilito piccoli animali ERG configurazioni per le misurazioni di ERG di zebrafish larvale. L’elettrodo è fatta facilmente utilizzando comune spugna di acetato di polivinile (PVA) e filo di argento fine senza qualsiasi altre attrezzature specializzate. I nostri dati indicano che questo romanzo elettrodo è sensibile e affidabile abbastanza per dimostrare lo sviluppo funzionale dei circuiti neurali retinici in zebrafish larvale tra 4 e 7 dpf. Questo elettrodo economico e pratico spugna-suggerimento può essere utile ai ricercatori che istituisce nuovi sistemi di ERG o la modifica di sistemi esistenti di piccoli animali, per gli studi di zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Letture di funzionali quali l’ERG sono diventati sempre più importanti in una suite di strumenti utilizzati per lo studio di zebrafish larvale8,9,12,14. A causa delle piccole dimensioni dell’occhio larvale zebrafish, micropipette di vetro sono state adattate come elettrodi di registrazione pubblicato più protocolli3,4,<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanziamento per questo progetto è stato fornito da una sovvenzione dell’Istituto di neuroscienze di Melbourne (di PTG, PRJ & BVB).
Materials
| 0.22 µm filter | Millex GP | SLGP033RS | Filters the 10× goldfish ringer's buffer for sterilizatio |
| 1-mL syringe | Terumo | DVR-5175 | With a 30G × ½" needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals. |
| 30G × ½" needle | Terumo | NN*3013R | For adding saline toteh sopnge tip electrode. |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML135 | For amplifying ERG signals. |
| Bleach solution | King White | 9333441000973 | For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite. |
| Circulation water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | Used to make the water-heated platfrom. |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier. |
| Faraday Cage | Photometric Solution International | For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio. | |
| Ganzfeld Bowl | Photometric Solution International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size. | |
| Luxeon LEDs | Phillips Light Co. | For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the recording electrode during experiments. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | Spreadsheet software for data analysis. |
| Moisturizing eye gel | GenTeal Gel | 9319099315560 | Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980. |
| Pasteur pipette | Copan | 200C | Used to caredully transfer larval zebrafish. |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML785 | Controls the LEDs to generate stimuli. |
| PVA sponge | MeiCheLe | R-1675 | For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti |
| Saline solution | Aaxis Pacific | 13317002 | For electroplating silver wire electrode. |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make recording and reference ERG electrodes. |
| Stereo microscope | Leica | M80 | Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement. |
| Tricaine | Sigma-aldrich | E10521-50G | For anaethetizing larval zebrafish. |
| Water-heated platform | custom-made | For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings |
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