En ny metode til forberedelse af prøven blev udviklet for at imødekomme celle og væv coculture for at opdage små molekyle udveksling ved hjælp af billedbehandling massespektrometri.
Imaging massespektrometri (IMS) er rutinemæssigt blevet anvendt på tre typer af prøver: væv sektioner, spheroids og mikrobielle kolonier. Disse prøve typer har været analyseret ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation time of flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) for at visualisere fordelingen af proteiner, lipider og metabolitter på tværs af den biologiske prøve af interesse. Vi har udviklet en roman prøve forberedelse metode, der kombinerer styrken af de tre tidligere ansøgninger til at tage en underexplored tilgang til at identificere kemiske kommunikation i kræft, ved såning pattedyr cellekulturer til Agarosen i coculture med sundt væv efterfulgt af udtørring af prøven. Mammale væv og celler er cocultured i umiddelbar nærhed af tillader kemisk kommunikation via diffusion mellem væv og celler. På særlige tidspunkter tørres Agarosen-baserede prøven på samme måde som mikrobielle kolonier forberedt til IMS analyse. Vores metode blev udviklet til model kommunikation mellem høj grade serøs æggestokkræft stammer fra æggelederen som det interagerer med æggestokken under metastaser. Optimering af prøveforberedelsen resulterede i identifikation af noradrenalin som et nøgleelement i æggestokkene mikromiljø kemiske. Dette nyligt udviklede metode kan anvendes til andre biologiske systemer, der kræver en forståelse for kemisk kommunikation mellem tilstødende celler eller væv.
Imaging massespektrometri (IMS) har været optimeret til at karakterisere den geografiske fordeling af molekylære funktioner i tre almindeligt brugte programmer: væv skiver, spheroids og mikrobielle kolonier1,2,3. Væv skiver kan bruges til at evaluere lokalisering af metabolitter i forbindelse med biologiske forhold i et værtsland, enten målrettet eller ikke-målrettede inden for en bestemt masseinterval. Men forskellene mellem molekylære funktioner er den vigtigste og mest indlysende når et sundt væv er i forhold til en syge tilstand, for eksempel, en tumor. Denne IMS tilgang er særligt tilpasset til påvisning af sygdommen biomarkører, dog erhverve vævsprøver ved diskrete stadier i sygdomsprogression (f.eks tumor lønklasse) er til hinder for identifikation af signaler, der kunne være vigtige for indledningen af den sygdom. Udveksling af oplysninger gennem rummet er en allestedsnærværende funktion af mange biologiske systemer, og væv skiver kan ikke indfange denne dynamiske kemiske relæ. En teknik, der er i stand til at visualisere kemiske exchange og diffusion er IMS af mikrobielle kolonier dyrkes på agar plader; små molekyler kan diffuse gennem og på tværs af agar og kan hentes via matrix assisted laser desorption/Ionisation (MALDI-TOF) massespektrometri4. Denne vækst opsætning kan bruges til at identificere molekyler udveksles mellem diskrete biologiske enheder (kolonier) og kan også bestemme retningen af metabolitten produktion. Platformen oprindeligt designet til kimtal vækst blev tilpasset til at udforske den primære metabolisme af væv explants vokset med pattedyrceller, og IMS blev brugt til at evaluere den dynamiske kemiske exchange i en in vitro-pattedyr system.
I de sidste mange år, er det blevet klart, at høj kvalitet serøs ovariecancer (HGSOC) ofte stammer i æggelederen epitel (FTE) og derefter metastasizes til æggestokkene under tidlig sygdom udvikling5,6, 7 , 8. grunden til at tumorfremkaldende FTE celler spredning til æggestokkene, hvor store tumorer i sidste ende udgør og metastaserer yderligere, er i øjeblikket uklart. Tidligere forskning har fokuseret på rollen som æggestokkene proteiner i primære metastaser til æggestokkene; Det er imidlertid for nylig påvist, at overgangen fra en sund til en tumorfremkaldende væv resulterer i massive afbrydelse af cellulære metabolisme og ændrer produktion af små molekyler9,10,11. Derfor, vi hypotese at små molekyler udveksles mellem FTE og æggestokkene kan være delvis ansvarlig for primære metastase af HGSOC.
Ved hjælp af vores nyudviklede IMS procedure, har vi besluttet, at coculture af tumorfremkaldende FTE og sunde æggestokkene væv inducerer produktion af noradrenalin fra æggestokken. Men andre celletyper eller normale FTE celler ikke fremkalde denne virkning. En ekstraordinær fordel ved denne metode er, at den molekylære produktion og udveksling af signaler, der repræsenterer virkelige molekyler kan visualiseres, så selv i en coculture er det muligt at fastslå kilden til et signal. Dette er en fordel i forhold til analysen af homogeniserede prøver, hvor alle geografisk information går tabt. I vores modelsystem kunne vi tydeligt tildele æggestokken produktion af noradrenalin. Noradrenalin er blevet forbundet med metastaser og chemoresistance af ovariecancer, og vores påvisning af dette molekyle har valideret at metoden roman IMS kan afdække biologisk relevante molekyler12,13, 14. denne validering lader os foreslå, at dette nye program for IMS kan være særligt nyttigt til forskergrupper, der forsøger at identificere små molekyler i coculture miljøer og for at forstå de tidlige begivenheder, der påvirker celle transformation og metastaser. Det overordnede mål med denne metode er at belyse identitet og rumlige fordeling af små molekyler under udveksling mellem væv og organer, repræsenteret ved in vitro- 3D cellekulturer eller ex vivo væv.
Der er en voksende mængde af beviser, der implicerer noradrenalins rolle i HGSOC12,17,18, og denne teknik har bidraget mere mekanistiske information. Med mindst otte biologiske betingelser til stede på det samme dias, kan metoden tegner sig for biologisk kontrol såsom gen samt celle specificitet og medier kontrol i en enkelt IMS opstille. Mens metoden var optimeret til at vurdere udveksles små molekyler i en model af primær…
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen blev leveret af Chicago biomedicinsk konsortiet med støtte fra Searle midler på The Chicago Fællesskabet Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago start midler (L.M.S.); Grant 543296 fra kræft i æggestokkene forskning fond Alliance (MD); og UG3 ES029073 (J.E.B.) og af det nationale Center for fremme translationel videnskab, National Institute of Health, gennem tilskud UL1TR002003 (JEB & LMS).
15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |