לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה
Summary
שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.
Abstract
הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) באופן שגרתי הוחלה על שלושה סוגים של דוגמאות: מקטעי רקמת spheroids, מושבות חיידקים. סוגי דגימה אלה יש נותחו באמצעות לייזר בסיוע מטריקס (MALDI-TOF MS) ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה desorption/יינון להמחיש את ההפצה של חלבונים, ליפידים ו מטבוליטים מעבר הדגימה הביולוגי של עניין. פיתחנו שיטה הכנה מדגם רומן המשלב את נקודות החוזק של היישומים הקודמת שלוש לפנות בגישה כשתפסעו לצורך זיהוי תקשורת כימית ב סרטן, על ידי זריעה בתרבית של תאים מהונדסים לתוך agarose ב coculture עם רקמות בריא ואחריו לייבוש של המדגם. בתרבית של רקמות ותאים cocultured בסמיכות המאפשר תקשורת כימית באמצעות דיפוזיה בין רקמת תאים. בנקודות זמן מסוימות, המדגם מבוססי agarose הוא מיובש באותו אופן כמו מושבות חיידקים מוכן לניתוח IMS. השיטה שלנו פותחה על מודל התקשורת בין סרטן השחלות הצפק כיתה גבוהה, נגזר החצוצרה כמו זה מקיים אינטראקציה עם השחלה במהלך גרורות. אופטימיזציה של הכנת המדגם הביאו הזיהוי של נוראדרנלין בתור מרכיב כימי מפתח microenvironment השחלות. פיתח שיטה זו ניתן ליישם מערכות ביולוגיות אחרות הדורשות הבנה של תקשורת כימית בין תאים סמוכים או רקמות.
Introduction
הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS) מוטבה כדי לאפיין את התפוצה המרחבית של תכונות מולקולרית ב שלושה יישומים בשימוש נרחב: פרוסות רקמות, spheroids ומושבות חיידקים1,2,3. פרוסות רקמות ניתן להעריך הלוקליזציה של מטבוליטים בהקשר של תנאי ביולוגי מחשב מארח, ממוקד או untargeted בתוך טווח מסוים המוני. עם זאת, הבדלים בין התכונות מולקולרית הם הכי משמעותי, ברור כאשר רקמה בריאה לעומת מצב חולני, לדוגמה, גידול. גישה זו IMS הוא מותאם במיוחד זיהוי סמנים למחלת, עם זאת, רכישת דגימות רקמה בשלבים דיסקרטית בהתקדמות המחלה (כגון ציונים הגידול) מונע זיהוי אותות יכול להיות חשוב לטקס החניכה של המחלה. חילופי מידע דרך החלל הוא תכונה בכל מקום של מערכות ביולוגיות רבות, רקמות פרוסות אינה יכולה ללכוד את ממסר כימי דינמי. טכניקה אחת המסוגלת להמחיש כימי exchange ודיפוזיה היא IMS של מושבות חיידקים גדל על פלטות אגר; מולקולות קטנות מסוגלים לנטרל את דרך ומעבר של אגר, ניתן ללכוד באמצעות ספקטרומטר מסה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI-TOF)4. תוכנית התקנה זו הצמיחה יכול לשמש כדי לזהות מולקולות המוחלפות בין ישויות ביולוגיות דיסקרטית (מושבות), באפשרותך גם לקבוע כיוון מטבוליט הייצור. פלטפורמת תוכנן במקור לצמיחה מושבת חיידקים הותאם לחקור את חילוף החומרים העיקרי של רקמות explants גדל עם בתרבית של תאים, IMS שימש כדי להעריך את ההחלפה כימי דינמי במערכת יונקים במבחנה.
מספר השנים האחרונות, הוא הפך ברור כי ציון גבוה סרטן שחלות נסיובי (HGSOC) לעיתים קרובות מהכנסותיהן האפיתל החצוצרה (FTE) ואז מתפשט השחלה במהלך בתחילת המחלה פיתוח5,6, 7 , 8. הסיבה tumorigenic FTE תאים התפשט אל השחלה, איפה גידולים גדולים בסופו של דבר יוצרים, גרורות נוספות, ברור כעת. מחקרים קודמים התמקדה התפקיד של חלבונים השחלות ב ראשי גרורות אל השחלה; עם זאת, זה לאחרונה הוכח כי המעבר בריאה טישו tumorigenic גורמת הרס גדול של חילוף החומרים הסלולר ומשנה את הייצור של מולקולות קטנות9,10,11. לכן, אנחנו שיערו כי מולקולות קטנות המוחלפות בין FTE את השחלה עשויים להיות אחראים חלקית גרורות העיקרי של HGSOC.
באמצעות הליך IMS פיתח שלנו, יש לנו נחוש כי coculture של tumorigenic FTE ורקמות השחלות בריא גורם הייצור של נוראדרנלין מן השחלה. עם זאת, תאים נורמליים FTE או סוגי תאים אחרים לא זכה אפקט זה. יתרון יוצאת דופן של שיטה זו הוא כי ניתן לאבחן את הייצור המולקולרי ואת חילופי אותות המייצגים מולקולות אמיתי, כך גם ב- coculture זה אפשרי לקבוע את מקור האות. נמצא יתרון על פני ניתוח דוגמאות הומוגני, כל המידע המרחבי אבוד. במערכת מודל שלנו, היינו יכולים להקצות באופן ברור את הייצור של נוראדרנלין השחלה. נוראדרנלין נקשר גרורה של chemoresistance של סרטן השחלות, שלנו זיהוי של מולקולה זו אומתה כי השיטה IMS הרומן יכול לחשוף מולקולות ביולוגית רלוונטית12,13, 14. אימות זה מאפשר לנו להציע כי היישום החדש הזה של IMS יכול להיות שימושי במיוחד למחקר קבוצות אשר מנסים לזהות מולקולות קטנות בסביבות coculture, כדי להבין בתחילת האירועים המשפיעים על טרנספורמציה תא גרורות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להבהיר את הזהות ואת התפוצה המרחבית של מולקולות קטנות במהלך חילופים בין רקמות ואיברים, המיוצג על-ידי במבחנה תרביות תאים תלת-ממד או רקמות ex-vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
יש גופה הגוברת של ראיות שמסבך את התפקיד של נוראדרנלין HGSOC12,17,18, טכניקה זו תרמה מכניסטית יותר מידע. עם תנאים ביולוגית לפחות שמונה קיים על השקופית אותו, השיטה יכולה להתחשב ביולוגית פקדים כגון ג’ין, ירידה לפרטים תא, כמו גם הפקדים מדיה IMS יחיד לה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מימון סופק על ידי האיחוד ביו שיקגו עם תמיכה מקרנות סרל ב שיקגו הקהילה הקרן (C-076) (L.M.S.); אוניברסיטת אילינוי בשיקגו הפעלה קרנות (L.M.S.); מענק 543296 של הברית הקרן לחקר סרטן השחלות (רופאה); UG3 ES029073 (J.E.B.), על ידי המרכז הלאומי עבור קידום Translational מדעי, המכון הלאומי לבריאות, דרך גרנט UL1TR002003 (ג’ב & LMS).
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
