इमेजिंग द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ऊतकों और कोशिकाओं के बीच छोटे अणु संचार पर कब्जा
Summary
नमूना तैयार करने की एक उपंयास विधि कोशिका और ऊतक coculture को समायोजित करने के लिए छोटे अणु का पता लगाने के लिए इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग विनिमय विकसित किया गया था ।
Abstract
इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) के नमूने के तीन प्रकार के लिए नियमित रूप से लागू किया गया है: ऊतक वर्गों, spheroids, और माइक्रोबियल कालोनियों. इन नमूना प्रकार का उपयोग कर विश्लेषण किया गया है मैट्रिक्स की सहायता से लेजर विशोषण/ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF MS) प्रोटीन, लिपिड के वितरण की कल्पना करने के लिए, और ब्याज के जैविक नमूना भर चयापचयों. हम एक उपंयास नमूना तैयार करने की विधि है कि तीन पिछले अनुप्रयोगों की ताकत को जोड़ती कैंसर में रासायनिक संचार की पहचान करने के लिए एक underअन्वेषित दृष्टिकोण को संबोधित विकसित किया है, में ऐगेरोस में स्तनधारी सेल संस्कृतियों बोने के द्वारा स्वस्थ ऊतकों के साथ सहसंस्कृति जिसके बाद नमूने का सुखाना होता है. स्तनधारी ऊतक और कोशिकाओं को ऊतक और कोशिकाओं के बीच प्रसार के माध्यम से रासायनिक संचार की अनुमति करीब निकटता में cocultured हैं । विशिष्ट समय बिंदुओं पर, ऐगरोस-आधारित प्रतिदर्श को आईएमएस विश्लेषण के लिए तैयार माइक्रोबियल कालोनियों के रूप में एक ही तरीके से सुखा लिया जाता है । हमारी विधि के लिए उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि के कैंसर के बीच संचार मॉडल विकसित किया गया था फैलोपियन ट्यूब के रूप में यह मेटास्टेसिस के दौरान अंडाशय के साथ इंटरैक्ट करता है । नमूना तैयारी के अनुकूलन के परिणामस्वरूप डिम्बग्रंथि microenvironment में एक प्रमुख रासायनिक घटक के रूप में norepinephrine की पहचान । यह नव विकसित विधि अंय जैविक प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है कि आसंन कोशिकाओं या ऊतकों के बीच रासायनिक संचार की समझ की आवश्यकता है ।
Introduction
इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएमएस) तीन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया अनुप्रयोगों में आणविक सुविधाओं के स्थानिक वितरण की विशेषता के लिए अनुकूलित किया गया है: ऊतक स्लाइस, spheroids, और माइक्रोबियल कालोनियों1,2,3. ऊतक स्लाइस एक मेजबान में जैविक स्थितियों के संदर्भ में चयापचयों के स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो लक्षित या एक विशिष्ट मास रेंज के भीतर अलक्षित । हालांकि, आणविक सुविधाओं के बीच अंतर सबसे महत्वपूर्ण और स्पष्ट कर रहे हैं जब एक स्वस्थ ऊतक एक रोगग्रस्त हालत की तुलना में है, उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर. इस आईएमएस दृष्टिकोण विशेष रूप से रोग biomarkers का पता लगाने के लिए अनुकूलित है, तथापि, रोग प्रगति में असतत चरणों में ऊतक के नमूने प्राप्त (जैसे ट्यूमर ग्रेड के रूप में) संकेत है कि दीक्षा के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है की पहचान precludes रोग. अंतरिक्ष के माध्यम से सूचना के आदान प्रदान कई जैविक प्रणालियों की एक सर्वव्यापी सुविधा है, और ऊतक स्लाइस इस गतिशील रासायनिक रिले पर कब्जा नहीं कर सकते । एक तकनीक है कि रासायनिक विनिमय और प्रसार visualizing में सक्षम है माइक्रोबियल की कालोनियों के आईएमएस है आगर प्लेटों पर उगाया जाता है; छोटे अणुओं के माध्यम से और आगर भर में फैलाना कर सकते है और मैट्रिक्स के माध्यम से कब्जा कर लिया जा सकता है-लेजर desorption सहायता/ इस वृद्धि सेटअप असतत जैविक संस्थाओं (कालोनियों) के बीच विनिमय अणुओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह भी metabolite उत्पादन की दिशात्मकता का निर्धारण कर सकते हैं । मूल रूप माइक्रोबियल कॉलोनी विकास के लिए डिज़ाइन मंच स्तनधारी कोशिकाओं के साथ हो ऊतक explants के प्राथमिक चयापचय का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था, और आईएमएस एक विट्रो स्तनधारी प्रणाली में गतिशील रासायनिक विनिमय का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता था ।
पिछले कई वर्षों में, यह स्पष्ट हो गया है कि उच्च ग्रेड तरल डिम्बग्रंथि कैंसर (hgsoc) अक्सर फैलोपियन ट्यूब उपकला (fte) में निकलती है और फिर जल्दी रोग विकास के दौरान अंडाशय के लिए metastasizes5,6, 7 , 8. कारण यह है कि तुमॉर्जेनिक fte कोशिकाओं अंडाशय है, जहां बड़े ट्यूमर अंततः फार्म और metastasize के लिए फैला है, वर्तमान में स्पष्ट नहीं है । पिछले अनुसंधान अंडाशय के लिए प्राथमिक मेटास्टेसिस में डिम्बग्रंथि प्रोटीन की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है; हालांकि, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि संक्रमण से एक स्वस्थ ऊतक सेलुलर चयापचय के बड़े पैमाने पर व्यवधान में परिणाम और छोटे अणुओं9,10,11के उत्पादन बदल जाता है । इसलिए, हम कि fte और अंडाशय के बीच विनिमय छोटे अणुओं आंशिक रूप से hgsoc के प्राथमिक मेटास्टेसिस के लिए जिंमेदार हो सकता है डोडो ।
हमारे नव विकसित आईएमएस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने यह निर्धारित किया है कि ट्यूमोर्जेनिक फ्टे और स्वस्थ डिम्बग्रंथि ऊतक की सहसंस्कृति अंडाशय से नोरेपपीनेरीन के उत्पादन को प्रेरित करती है । हालांकि, अंय कक्ष प्रकारों या सामांय FTE कक्षों ने इस प्रभाव को प्राप्त नहीं किया । इस विधि का एक असाधारण लाभ यह है कि आणविक उत्पादन और संकेतों का आदान-प्रदान है कि वास्तविक अणुओं का प्रतिनिधित्व visualized जा सकता है, तो भी एक coculture यह एक संकेत के स्रोत का निर्धारण करने के लिए संभव है में । यह homogenized नमूनों, जहां सभी स्थानिक जानकारी खो दिया है के विश्लेषण पर एक फायदा है । हमारे मॉडल प्रणाली में, हम स्पष्ट रूप से अंडाशय को norepinephrine के उत्पादन को निर्दिष्ट करने में सक्षम थे । Norepinephrine मेटास्टेसिस और डिम्बग्रंथि के कैंसर के chemoresistance से जुड़ा हुआ है, और हमारे इस अणु का पता लगाने की पुष्टि की है कि उपंयास आईएमएस विधि जैविक रूप से प्रासंगिक अणुओं को उजागर कर सकते है12,13, 14. इस मांयता की मदद से हमें प्रस्ताव है कि आईएमएस के इस नए आवेदन विशेष रूप से अनुसंधान समूहों है कि coculture वातावरण में छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए प्रयास कर रहे है और जल्दी घटनाओं को समझने के लिए उपयोगी हो सकता है कि प्रभाव कोशिका परिवर्तन और मेटास्टेसिस । इस विधि का समग्र लक्ष्य ऊतकों और अंगों के बीच विनिमय के दौरान छोटे अणुओं की पहचान और स्थानिक वितरण को स्पष्ट करना है, या तो विट्रो 3d सेल संस्कृतियों या पूर्व vivo ऊतक में द्वारा प्रतिनिधित्व किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां सबूत है कि hgsoc12,17,18में norepinephrine की भूमिका को फंसाने के एक बढ़ती शरीर है, और इस तकनीक को और अधिक यंत्रवत जानकारी का योगदान दिया है । एक ही स्लाइड पर मौजूद कम से आठ जैविक स्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान शिकागो सामुदायिक ट्रस्ट (C-०७६) (L.M.S.) में Searle धन से समर्थन के साथ शिकागो बायोमेडिकल कंसोर्टियम द्वारा प्रदान की गई थी; शिकागो स्टार्टअप फंड (L.M.S.) में इलिनोइस विश्वविद्यालय; डिम्बग्रंथि कैंसर रिसर्च फंड एलायंस (एमडी) से ५४३२९६ अनुदान; और UG3 ES029073 (J.E.B.) और राष्ट्रीय ट्रांसलेशनल साइंसेज, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, अनुदान UL1TR002003 (JEB & LMS) के माध्यम से आगे बढ़ाने के लिए केंद्र द्वारा ।
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
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