Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama
Summary
Numune hazırlama bir roman yöntemi görüntüleme kütle spektrometresi kullanılarak küçük molekül alışverişte algılamak için hücre ve doku coculture karşılamak için geliştirilmiştir.
Abstract
Kütle spektrometresi (IMS) görüntüleme rutin olarak uygulanmış örnekleri üç tür: doku bölümler, pulcuklarının ve mikrobiyal koloniler. Bu örnek türleri faiz biyolojik örnek arasında proteinler, lipidler ve metabolitleri dağılımını görselleştirmenizi matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma uçuş zaman kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS) kullanılarak analiz. Memeli hücre kültürleri içinde özel içine tohum tarafından kanser, kimyasal iletişim tanımlamak için underexplored bir yaklaşım adrese üç önceki uygulama güçlü bir araya getiren bir roman örnek hazırlama yöntemi geliştirdik sağlıklı dokulara kuruma örnek tarafından takip ile coculture. Memeli doku ve hücreleri yakın üzerinden Difüzyon doku ve hücreleri arasındaki kimyasal iletişim sağlayan cocultured. Zaman belirli noktalarda, mikrobiyal kolonileri IMS analiz için hazırlanan aynı şekilde özel tabanlı örnek kurutulur. Bizim yöntem yüksek dereceli seröz over kanseri metastaz sırasında yumurtalık ile etkileşim gibi fallopian tüp sizden türetilmiş arasındaki iletişimi modellemek için geliştirilmiştir. Numune hazırlama duruma getirilmesi norepinefrin kimlik anahtar kimyasal bileşen olarak yumurtalık microenvironment sonuçlandı. Yeni geliştirilen bu yöntem bitişik hücreleri veya doku arasındaki kimyasal iletişim bir anlayış gerektiren diğer biyolojik sistemleri uygulanabilir.
Introduction
Kütle spektrometresi (IMS) görüntüleme en iyi duruma getirilmiş üç yaygın olarak kullanılan uygulamalarda moleküler özelliklerinin mekansal dağılımı niteleyen: dokusu dilimlerin, pulcuklarının ve mikrobiyal kolonileri1,2,3. Dokusu dilimlerin metabolitleri, hedeflenen ya da belirli bir kitle aralığı içinde hedefsiz bir ev sahibi, biyolojik koşullar bağlamında lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Ancak, bir sağlıklı doku hastalıklı bir durum, örneğin, bir tümör karşılaştırıldığında moleküler özellikleri arasındaki farklar en önemli ve açık vardır. Bu IMS yaklaşım özellikle hastalık biyolojik tespiti için adapte, ancak, hastalık ilerleme (tümör notlar gibi) farklı aşamalarında doku örnekleri alınıyor kabul töreni için önemli olabilir sinyalleri tanımlaması engellemektedir hastalık. Uzayda bilgi alışverişi birçok biyolojik sistemleri her yerde bulunan bir özelliktir ve dokusu dilimlerin dinamik bu kimyasal aktarma yakalamak değildir. Kimyasal değişimi ve Difüzyon görselleştirme kapasitesine sahip bir mikrobiyal kolonileri Ağar kaplamalar üzerinde yetiştirilen IMS tekniktir; küçük moleküller aracılığıyla ve agar genelinde yaygın edebiliyoruz ve matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma (MALDI-TOF) kütle spektrometresi4yolu ile yakalanabilir. Bu büyüme Kur ayrı biyolojik varlıklar (kolonileri) arasında değiş tokuş molekülleri tanımlamak için kullanılan ve yön metaboliti üretim öğeleri de belirleyebilirsiniz. Mikrobiyal koloni büyüme için tasarlanan platformu doku explants memeli hücreleri ile yetiştirilen birincil metabolizma keşfetmek için adapte oldu ve IMS dinamik kimyasal değişimi tüp bebek bir memeli sisteminde değerlendirmek için kullanıldı.
Son birkaç yıl içinde yüksek dereceli seröz over kanseri (HGSOC) kez fallopian tüp epitel (FTE) kaynaklanan ve yumurtalık için erken hastalığı geliştirme5,6sırasında, metastaz açık hale gelmiştir 7 , 8. tumorigenic FTE nerede büyük tümör sonunda oluşturmak ve daha fazla metastaz, yumurtalık yayılmasına hücreleri nedeni şu anda belli değil. Önceki araştırma yumurtalık için birincil metastaz yumurtalık proteinlerin rolü üzerinde odaklanmıştır; Ancak, bu son zamanlarda tumorigenic bir doku için sağlıklı bir geçiş hücre metabolizması büyük bozulma sonuçları ve üretim küçük moleküller9,10,11değiştirir kanıtlanmıştır. Bu nedenle, biz olan küçük moleküller FTE yumurtalık arasında değiş tokuş kısmen HGSOC birincil metastaz için sorumlu olabilir.
Bizim yeni geliştirilen IMS işlemi uygulayarak, biz coculture tumorigenic FTE ve sağlıklı yumurtalık dokusu yumurtalık üzerinden norepinefrin üretimini indükler belirledik. Ancak, diğer hücre tipleri veya normal FTE hücreleri bu etkiyi temin değil. Bu yöntem olağanüstü bir avantajı nedir Moleküler üretim ve Satım gerçek moleküller temsil sinyallerin görselleştirildiği, bu yüzden bile bir coculture bir sinyalin kaynağını saptamak mümkündür. Bu analiz homojenize örnekleri, üzerinde bir avantaj nerede bütün mekansal bilgi kaybolur. Modeli sistemimizde açıkça norepinephrine üretimi için yumurtalık atamak başardık. Metastaz ve yumurtalık kanserlerinin chemoresistance norepinefrin bağlantılı ve bu molekül bizim tespiti roman IMS yöntemi biyolojik ilgili molekülleri12,13, ortaya çıkarabilir geçerliliği 14. bu doğrulama IMS bu yeni uygulama coculture ortamlarda küçük moleküller tanıtmakta ve hücre dönüşüm etkisi erken olayları anlamaya çalışıyorsunuz gruplar araştırma özellikle yararlı olabilir teklif izin veriyor ve metastaz. Bu yöntem genel kimlik ve küçük moleküller kayma dağılımını doku ve organları, vitro 3D hücre kültürleri veya ex vivo dokusu tarafından temsil edilen arasında değişim sırasında aydınlatmak için hedeftir.
Protocol
Representative Results
Discussion
HGSOC12,17,18norepinefrin’ın rolü implicates kanıt büyüyen bir ceset ve bu teknik daha mekanik bilgi katkıda bulunmuştur. Gen ve hücre özgüllük yanı sıra tek bir IMS medya denetimleri çalıştırmak gibi en az sekiz biyolojik koşullar ile aynı slayt üzerinde mevcut, biyolojik denetimler için yöntem hesap. Yöntem optimize edildi, ancak değerlendirmek için birincil metastaz HGSOC, herhangi bir hücre, bir mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansman desteği ile Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu tarafından Chicago toplum güven (C-076) (L.M.S.); Searle fonlarından sağlanan University of Illinois Chicago başlangıç (L.M.S.) fonları; Grant 543296 üzerinden yumurtalık kanseri araştırma fonu İttifak (MD); ve UG3 ES029073 (J.E.B.) ve Ulusal Merkezi ilerleyen translasyonel Bilimler, Ulusal Enstitüsü sağlık, hibe UL1TR002003 yoluyla (JEB & LMS) tarafından.
Materials
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
