マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング
Summary
ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。
Abstract
膵島ホルモンは血糖恒常性を調節する。血糖値の変化は、膵島の細胞内の細胞質カルシウムの発振を誘発し、インスリン(β細胞から)、グルカゴン(α細胞)、ソマトスタチン(δ細胞)の3つの主要なホルモンの分泌を引き起こす。大多数の小有限細胞を構成し、互いに電気的に結合しているβ細胞は、グルコース刺激に対して1つの単一の実体として応答する。マイナーな部分集団、α細胞およびδ細胞の興奮性(約20%(30%)を占める4% (10%)総げっ歯類1(ヒト2)島の細胞数のそれぞれ)は、予測しにくいので、特別な関心がある。
カルシウムセンサは、単離された小石内の細胞の末梢層に送達されます。島または小島のグループは、蛍光顕微鏡を使用して固定化され、画像化されます。イメージングモードの選択は、より高いスループット(広視野)とより良い空間分解能(共焦点)の間です。従来、レーザー走査共焦点顕微鏡は、隣接する細胞間のシグナルの最適な分離を提供するので、組織のイメージングに使用される。β細胞の支配集団からの汚染信号が最小限に抑えられるならば、広視野システムも利用することができる。
特定の刺激に応答してカルシウムダイナミクスが記録されると、データは蛍光強度対時間として数値形式で表され、初期蛍光およびベースライン補正に正規化され、漂白に関連する効果を除去する。蛍光体。曲線下のスパイク周波数または部分領域(pAUC)の変化は、観測された効果を定量するために、時間対時間を計算する。pAUCはより敏感で非常に堅牢であるのに対し、スパイク周波数はカルシウム増加のメカニズムに関するより多くの情報を提供します。
マイナーな細胞のサブ集団は、アドレナリンやグレリンなどのマーカー化合物に対する機能的応答を用いて同定することができ、これは島細胞の特定の集団における細胞質カルシウムの変化を誘発する。
Introduction
この方法の目的は、膵島細胞の小さな部分集団における細胞質カルシウム濃度([Ca2+cyt)のリアルタイム変化を画像化することです。これにより、これらの細胞におけるホルモン分泌を支配するメカニズムを明らかにし、異なる細胞型間のクロストークに関する詳細を明らかにし、潜在的に、集団次元を大きな画像に導入することができます。
島は複数の細胞タイプで構成されています。よりよく知られているインスリン分泌β細胞に加えて、血糖3の調節にも重要な少なくとも2つの亜集団がある。α細胞(島の細胞の約17%を構成する)は、血糖値が低くなりすぎるとグルカゴンを分泌し、肝臓のデポから血流にブドウ糖を放出するシグナルを送ります。過剰なグルカゴンレベル(高グルカゴネミア)およびグルカゴン放出の制御障害(および、技術的には、インスリン感受性障害の糖尿病状態に寄与し得る)4.δ細胞(約2%)グルコース上昇に応答してソマトスタチンを分泌する。このユビキタスペプチドホルモンは、小島内のα-およびβ細胞の近傍に高濃度で存在する可能性が高く、グルカゴンおよびインスリン分泌の両方に強いGi受容体媒介性減衰効果を有する。
α-細胞とδ細胞は、グルコース感知機械の大部分を近い系統親であるβ細胞と共有しています。3種類の全ての細胞にATP感受性K+チャネルが装備されており、これらの興奮性細胞の形質膜電位を制御する精巧な代謝センサ5が備え付けられている。同時に、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンの分泌は、グルコースによって異なる方法で調節される。したがって、島細胞の2つの小さな部分集団におけるCa2+ダイナミクスのイメージングは、血糖値と島分泌出力との間のクロストークに関する洞察を提供することができる。
パッチクランプ電気生理学を用いてα細胞およびδ細胞の興奮性をモニタリングする初期の試みは、すぐに単一のα-およびδ細胞におけるCa2+のイメージングに続いた。これらの実験における細胞の同一性は、抗グルカゴンまたは抗ソマトスタチン抗体による後部染色を介して検証した。これらの努力は、イシレット細胞が大口内で、単一の細胞として非常に異なって動作するという発見によってしばしば妨げられた。β細胞は、島の配置の主な恩人であるように見えるかもしれませんが(その強力な電気結合の根底にある圧倒的多数のために)、主な不一致は、驚くべきことに、α細胞に見つかりました。無傷の小有限では、これらの細胞は常に低グルコースで持続的に活性化され、これは単一分散α細胞6の約7%に対してのみ当てはまる。従って無傷の小島内のα−およびδ細胞の活性を報告することは、生体内条件のより近い近似を表すと考えられる。
一般に、α細胞またはδ細胞の部分集団から特異的にCa2+ダイナミクスを報告する2つの方法があります:(i)組織特異的プロモーターを介して遺伝子コードされたCa2+センサーを発現する、または(ii)マーカー化合物を使用して。よりエレガントな前者のアプローチは真の3Dイメージングの実質的な利点を追加し、したがって、小有に細胞分布の研究。しかし、無傷のヒトの小米科材料には適用できません。もう一つの潜在的な懸念は、特に高グルコースに対するβ/α細胞トランス分化またはα細胞応答が実施されている場合に、プロモーターの「漏れ」である。後者のアプローチは、ヒトサンプルまたは培養小島を含む新鮮な単離された組織で使用することができる。しかし、このデータは、イシレットアーキテクチャを変えることなく、より深い層に色素/マーカー分子を送り出すので、イレット細胞の末梢層からのみ収集されます。後者のアプローチの予想外の利点は、広視野イメージングモードとの互換性であり、実験を数百または数百の小島(すなわち数千から数万の細胞)の同時イメージングにスケールアップすることができます。
カルシウムは、遺伝子コードされたGCaMP7(またはペリカム8)ファミリーセンサを用いて生体内で画像化され、これは、カルシウム結合タンパク質カルモジュリンとその標的配列に融合した円形に透過緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体であり、ミオシン軽鎖キナーゼ7、9のM13断片である。GCaMPは、ナノモルCa2+濃度の範囲で優れた信号対雑音比を有し、高い2光子断面を有し、生体内作業10、11に最適です。組換えセンサーを使用する難しい側面は、細胞への配信です。異種発現は、ウイルスベクターと複数時間のex vivo培養を使用する必要があり、これは細胞機能の潜在的な分化または悪化に関する懸念を頻繁に提起する。GCaMP を表現するように設計されたマウス モデルは、この問題に対処するために事前に設計されていますが、リード タイムを大幅に増やし、作業を非人間モデルに制限することで、新たな課題を追加します。細胞内pHの変化に対する非常に高い感受性は、タンパク質ベースのセンサ12のもう一つの不利な側面であり、しかし、Ca2+のような振動信号を感知する問題は少ない。
トラップ可能な色素(緑色蛍光Fluo4など)の利点は、約1時間以内に新鮮に単離された組織にロードできることです。予想通り、トラップ可能な染料は、組換えの色素よりも信号対雑音比が低く、(はるかに)光安定性が低くなります。トラップ可能色素14の毒性の報告を13件確認することはできないが、染料の過負荷が頻繁に問題となる。
円形順列に基づく赤色組換えCa2+センサーは、2011年15年から急速に進化しており、最近の開発は、赤色光の浸透深さが高いことを考えると、組織イメージングのためのGCaMP16に強い競争を示しています。市販の赤色捕捉性染料は、単一細胞イメージングに確実に使用できますが、組織レベルでは、緑色のアナログとうまく競合することはできません。
焦点が合っていない光が重大な問題となる組織の実験のためのイメージング技術の選択は一見ほとんどない。共焦点システムは、0.3(GCaMP6の場合)または0.8(トラップ可能な色素)上の任意の目的で焦点外光のキャンセルによって許容可能な単一細胞分解能を提供します。技術的な意味では、従来の共焦点顕微鏡は、数百個(GCaMP)または数十個の小島(トラップ可能な色素)から[Ca2+]の円を同時にイメージングするために使用することができます。組織におけるセンサの3D発現の場合の共焦点モードに対する唯一の現実的な代替手段は、おそらく光シート顕微鏡である。
センサーが小別の組織内の細胞の末梢層で発現する場合、物事はわずかに異なります。鮮やかな細胞内発現パターンを持つ明るい組換えセンサの場合、低NA目標の広視野イメージングモードを使用すると、十分な品質を提供し、視野領域の大幅な増加を研究者に報い、したがって、スループット。広いフィールド システムでは、フォーカスの低いライトがキャンセルされないので、空間的な解像度が低くなります。したがって、単一細胞信号が隣接する細胞によって大きく汚染されるため、高NA(被写界深度の低い)目的を持つイメージング組織はあまり有益ではありません。汚染は低NA(被写界深度の高い)目標のためにはるかに小さい。
ただし、高いスループットやサンプリング レートが重要な利点となるタスクもあります。α-細胞とδ細胞は相当な不均一性を示し、サブ集団の寄与を明らかにするために高いサンプルサイズの需要を生み出す。広視野イメージングは高速で感度が高く、工業規模の大きな視野システムは、それぞれ10または1つの小島での共焦点実験と同じ信号対雑音比で数百個(GCaMP)または数十個(Fluo4)の小島をイメージングします。このスループットの違いは、単一細胞分解能を有する集団イメージングに広視野システムを有利にし、δ細胞1のような小さなサブ集団にとって特に重要であり得る。同様に、Ca2+スパイク17からの電気活動を再構築しようとする試みは、広視野イメージングモードによって提供されるより高いサンプリングレートの恩恵を受けるだろう。同時に、支配的なβ細胞部分集団の刺激時の膵臓α細胞の活性のようないくつかの「ニッチ」問題は、共焦点系の使用を必要とする。共焦点モードに向けた決定に影響を与える要因は、β細胞亜集団からの実質的な汚染シグナルの存在である。
イメージング実験後にホルモン特異的抗体染色を用いて細胞の同一性を検証することは依然として選択肢であるが、α-18およびδ細胞19、20におけるCa2+ダイナミクスを選択的に刺激することが示されたアドレナリンおよびグレリンなどの機能マーカー化合物を用いて、マイナー細胞亜集団を同定することができる。
タイムラプスイメージングデータの分析は、集団の不均一性、相関、異なるシグナルの相互作用など、些細な薬理学を超えた情報を提供することを目的としています。従来、撮像データは強度対時間として解析され、初期蛍光に正規化される(F/F0)。ベースライン補正は、蛍光またはpHの変化による蛍光対気のシグナルの漂白または汚染に起因して頻繁に必要である(典型的にはグルコース12のミリモルレベルによって誘発される)。Ca2+データはさまざまな方法で分析できますが、3 つの主な傾向は、スパイク周波数、高原分数、または曲線の下の面積の変化を計算した場合と時間の値を測定することです。後者のアプローチは、特に重くアンダーサンプリングされた共焦点データへの適用において有利であることがわかりました。pAUCメトリックの利点は、信号周波数と振幅の両方の変化に対する感度であるのに対し、周波数を計算するには、従来のイメージングを使用して達成するのが困難であるかなりの数の振動21が必要である。pAUC分析の制限要因は、ベースラインの変化に対する高い感度です。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルには、全体的な成功に不可欠な 3 つの段階があります。胆管へのリベラーゼ酵素の注入の成功は、単離手順の定量的成功だけでなく、単離された島の品質にも影響を与えます。膨張していない膵臓は、単離された小島でいくつかの重要な代謝応答の欠如をもたらす可能性があります。第二に、センサの色素/発現の負荷は、タイムラプス記録の信号対雑音比を定義する。過負荷の小…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AHは糖尿病英国博士課程の学生シップの受領者であり、EVはOXION-ウェルカム・トラスト・トレーニング・プログラムの支援を受け、AITはオックスフォード生物医学研究評議会の博士研究員を開催しました。
Materials
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Аldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | ThermoFisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Аldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
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