Her præsenterer vi en protokol for billeddannelse og kvantificering af calcium dynamik i heterogene cellepopulationer, såsom pancreas-ø-celler. Fluorescerende reportere leveres ind i det perifere lag af celler inden for øen, som derefter er immobiliseret og imaged, og per-celle analyse af dynamikken i fluorescens intensitet udføres.
Pancreas ø hormoner regulere blodglucose homøostase. Ændringer i blodglucose inducere svingninger af cytosolisk calcium i bugspytkirtlen ø-celler, der udløser sekretion af tre vigtigste hormoner: insulin (fra β-celler), Glucagon (α-celler) og Somatostatin (δ-celler). β-celler, som udgør størstedelen af ø-celler og er elektrisk koblet til hinanden, reagerer på glukose stimulus som en enkelt enhed. Excitabiliteten af de mindre delpopulationer, α-celler og δ-celler (udgør ca. 20% (30%) og 4% (10%) af de samlede henholdsvis gnaver1 (2) ø-cellenumre) er mindre forudsigelige og derfor af særlig interesse.
Calcium sensorer leveres ind i det perifere lag af celler inden for den isolerede ø. Den ø eller en gruppe af Holme er derefter immobiliseret og afbildet ved hjælp af en fluorescens mikroskop. Valget af Imaging mode er mellem højere gennemløb (Wide-felt) og bedre rumlig opløsning (confocal). Konventionelt, Laserscanning confokal mikroskopi bruges til billedbehandlings vævet, da det giver den bedste adskillelse af signalet mellem de tilstødende celler. Et bredt felt system kan også udnyttes, hvis det kontaminerende signal fra den dominerende population af β-celler minimeres.
Når calcium dynamikken som reaktion på specifikke stimuli er blevet registreret, udtrykkes data i numerisk form som fluorescens intensitet vs. tid, normaliseret til den oprindelige fluorescens og baseline-korrigeret, for at fjerne virkningerne forbundet med blegning af fluoroforet. Ændringer i spids frekvensen eller delarealet under kurven (pAUC) er beregnet til at kvantificere de observerede virkninger. pAUC er mere følsom og ganske robust mens spiking frekvens giver mere information om mekanismen af calcium stigning.
Mindre celle delpopulationer kan identificeres ved hjælp af funktionelle reaktioner på markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der inducerer ændringer i cytosolisk calcium i en bestemt population af ø-celler.
Formålet med metoden er at billede real-time ændringer i cytosolisk calciumkoncentration ([ca2 +]Cyt) i mindre delpopulationer af bugspytkirtel ø-celler. Dette gør det muligt at afdække de mekanismer, der styrer hormon sekretion i disse celler, afslørende detaljer om krydstale mellem forskellige celletyper og potentielt introducere en populationel dimension i det større billede af ø-signalering.
Holme består af flere celletyper. Ud over de mere velkendte insulin-udskilning β-celler, der er mindst to subpopulationer, der er også afgørende for reguleringen af blodglukose3. α-celler (der udgør omkring 17% af ø-celler) udskiller Glucagon, når blodglucose bliver for lav, hvilket signalerer frigivelse af glucose i blodbanen fra depoter i leveren. Overdreven Glucagon-niveauer (hyperglucagonæmi) og nedsat kontrol af Glucagon-Release ledsage (og, teknisk, kan bidrage til) den prædiab etiske tilstand af nedsat insulinfølsomhed4. δ-celler (ca. 2%) udskiller somatostatin som respons på glukose højde. Dette allestedsnærværende peptidhormon vil sandsynligvis være til stede ved høje koncentrationer i nærheden af α-og β-celler inden for Holme, som har en stærk Gi Receptor-medieret formildende virkning på både Glucagon og insulinsekretion.
α-celler og δ-celler deler en stor del af de glukose-sensing maskiner med deres nære afstamning slægtninge, β-celler. Alle tre celler typer er udstyret med ATP-følsomme K+ kanaler, udførlige metaboliske sensorer5 , der styrer plasma membranpotentialet i disse overgearet celler. Samtidig reguleres udskillelsen af insulin, somatostatin og Glucagon forskelligt af glucose. Billeddannelse af ca2 + dynamik i de to mindre delpopulationer af ø-celler kan derfor give et indblik i Cross-Talk mellem blodglukose og ø-sekretions produktion.
Tidlige forsøg på at overvåge excitabiliteten af α-og δ-celler ved hjælp af patch-clamp Elektrofysiologi blev snart efterfulgt af billeddannelse af ca2 + i enkelt α-og δ-celler. Identiteten af celler i disse eksperimenter blev verificeret via en efterfølgende farvning med anti-Glucagon eller anti-somatostatin antistoffer. Disse bestræbelser blev ofte hæmmet af konstateringen af, at ø-celler opfører sig meget forskelligt inden for øen og som enkeltceller. Selv om β-celler kan synes at være de vigtigste velgørere af øen arrangement (på grund af deres overvældende flertal, der ligger til grund for deres stærke elektriske kobling), den største uoverensstemmelse var, overraskende, fundet i α-celler. Inden for den intakte ø er disse celler konstant og vedvarende aktiveret ved lavt glucose, hvilket kun gælder for ca. 7% af enkelt dispergerede α-celler6. Indberetning af aktiviteten af α-og δ-celler inden for intakte Holme menes derfor at repræsentere en tættere tilnærmelse af in vivo-betingelser.
Generelt er der to måder at rapportere ca2 + dynamik specifikt fra α-celle eller δ-celle delpopulationer: (i) at udtrykke en genetisk kodet ca2 + sensor via en vævs specifik promotor eller (II) ved hjælp af markør forbindelser. Den mere elegante tidligere tilgang tilføjer den betydelige fordel af ægte 3D-billeddannelse og dermed studere celle fordeling inden for øen. Det kan dog ikke anvendes på intakt menneskeligt ømateriale. En anden potentiel bekymring er den “lækage” af arrangøren, især når β-/α-celle-Trans differentiering eller α-celle respons på høj glukose er på plads. Sidstnævnte fremgangsmåde kan anvendes med frisk isoleret væv, herunder humane prøver eller dyrkede Holme. Dataene indsamles dog udelukkende fra det perifere lag af ø-celler, da det er udfordrende at levere farvestof/markør molekyle i dybere lag uden at ændre den ø-arkitektur. En uventet fordel ved sidstnævnte fremgangsmåde er kompatibiliteten med Wide-Field Imaging mode, som tillader opskalering af eksperimenter til simultan billeddannelse af titusinder eller hundredvis af Holme (dvs. tusinder til titusinder af celler).
Calcium er afbildet in vivo ved hjælp af genetisk kodet gcamp7 (eller pericam8) familie sensorer, som er varianter af cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (gfp) smeltet til calcium bindende protein calmodulin og dets mål sekvens, M13 fragment af myosin lyskæde kinase7,9. Gcamps har fremragende signal-til-støj-forhold i rækken af nanomolær ca2 + koncentrationer og et højt 2-foton tværsnit, hvilket gør dem til et ideelt valg til in vivo arbejde10,11. Det udfordrende aspekt ved at bruge rekombinante sensorer er deres levering i cellerne. Heterologe udtryk kræver brug af en viral vektor og multi-time ex vivo-dyrkning, som ofte giver anledning til betænkeligheder med hensyn til potentiel afsondring eller forringelse af celle funktioner. Selvom musemodeller, der er udviklet til at udtrykke GCaMP, løser dette problem, tilføjer de nye udfordringer ved at øge gennemløbstiden betydeligt og begrænse arbejdet til en ikke-menneskelig model. Meget høj følsomhed over for ændringer af intracellulær pH er en anden negativ side af protein-baserede sensorer12, hvilket dog er mindre af et problem for at detektere oscillatoriske signaler, såsom ca2 +.
Fordelen ved opfanges farvestoffer (såsom grøn fluorescerende Fluo4) er, at de kan indlæses i frisk isoleret væv inden for omkring en time. Forudsigeligt, opfanges farvestoffer har lavere signal-til-støj nøgletal og (meget) lavere foto stabilitet end deres rekombinante modparter. Vi kan ikke bekræfte13 rapporterne om toksicitet af de opfanges farvestoffer14, men farvestof overbelastning er et hyppigt problem.
Røde rekombinante ca2 + sensorer baseret på cirkulær permutation har udviklet sig hurtigt siden 201115, og den seneste udvikling udgør en stærk konkurrence til gcamps16 for vævs Imaging, givet højere dybde penetration af rødt lys. Kommercielt tilgængelige rød opfanges farvestoffer kan anvendes pålideligt til enkelt celle-billeddannelse, men på vævsniveau, kan ikke konkurrere godt med de grønne analover.
Der er tilsyneladende meget lidt valg af billedteknologi til eksperimenter i væv, hvor out-of-fokus lys bliver et kritisk problem. Konfokale system giver acceptabel enkelt celle opløsning ved annullering af out-of-fokus lys med ethvert mål på Na over 0,3 (for tilfælde af GCaMP6) eller 0,8 (trappable farvestof). I teknisk forstand kan et konventionelt Konfokal mikroskop anvendes til simultan billeddannelse af [ca2 +]Cyt fra hundredvis (gcamp) eller snesevis af Holme (trappable Dye). Det eneste realistiske alternativ til konfokale mode i tilfælde af 3D-ekspression af sensoren i væv er måske lysplade mikroskopi.
Tingene er lidt anderledes for tilfældet, når sensoren er udtrykt i det perifere lag af celler inden for ø-vævet. For lyse rekombinante sensorer, der har et levende intracellulært udtryks mønster, kan brug af en Wide-Field Imaging-tilstand med en lav-NA-målsætning give tilstrækkelig kvalitet og belønne forskeren med en betydelig stigning i synsfeltet område og dermed Overførselshastighed. Et bredt felt system giver dårligere rumlig opløsning, da ikke-fokus lyset ikke annulleres; Derfor er billedbehandlings vævet med høj-NA (lav dybde af felt) mål mindre informativ, da single-celle signalet er voldsomt forurenet af tilstødende celler. Forureningen er meget mindre for lav-NA (høj dybde af felt) mål.
Der er dog opgaver, hvor høj dataoverførselshastighed og/eller samplingsfrekvens bliver en kritisk fordel. α-og δ-celler udviser betydelig heterogenitet, hvilket skaber en efterspørgsel efter høje stikprøvestørrelser for at afsløre subpopulationernes bidrag. Wide-felt Imaging er hurtig og mere følsom, med en industriel skala store Field-of-View system Imaging hundredvis (gcamp) eller TENS (Fluo4) af Holme ved samme signal-støj-forhold som de konfokale eksperimenter på ti eller en enkelt ø, hhv. Denne forskel i gennemløb gør det brede felt system fordelagtigt for befolkningsmæssige Imaging med en enkelt celle opløsning, som kan være særligt kritisk for små subpopulationer som δ-celle en. På samme måde vil forsøg på at rekonstruere elektrisk aktivitet fra ca2 + spiking17 drage fordel af den højere samplingfrekvens, der leveres af en Wide-Field Imaging-tilstand. På samme tid, flere “niche” problemer som aktiviteten af bugspytkirtel α-celler ved stimulering af den dominerende β-celle subpopulation, kræver brug af en konfokale system. En faktor, der påvirker beslutningen mod konfokale mode er tilstedeværelsen af betydelige kontaminerende signal fra β-celle subpopulation.
Selv om du bruger hormon-specifik antistof farvning til at kontrollere identiteten af cellerne efter billeddannelse eksperimenter er stadig en mulighed, kan mindre celle delpopulationer identificeres ved hjælp af funktionelle markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der blev vist at selektivt stimulere ca2 + dynamik i α-18 og δ-celler19,20, hhv.
Analysen af tidsforskudt billeddata har til formål at give oplysninger ud over triviel farmakologi, såsom populationelle heterogenitet, korrelation og interaktion mellem forskellige signaler. Konventionelt, imaging data analyseres som intensitet vs. tid og normaliseret til den oprindelige fluorescens (F/F0). Der er ofte behov for korrektion ved baseline på grund af blegning af fluoroforet-signalet eller kontaminering ved ændringer i autofluorescens eller ph (typisk induceret af millimolære niveauer af glucose12). Ca2 + data kan analyseres på mange forskellige måder, men tre vigtigste tendenser er at måle ændringer i Spike frekvens, plateau fraktion, eller område under kurven, beregnet vs. tid. Vi fandt den sidstnævnte fremgangsmåde fordelagtig, især i anvendelse på stærkt under samplede konfokale data. Fordelen ved pAUC metrisk er dens følsomhed over for både ændringer i signal frekvens og amplitude, hvorimod beregning af frekvensen kræver et betydeligt antal oscillationer21, hvilket er svært at opnå ved hjælp af konventionel billeddannelse. Den begrænsende faktor for pAUC analyse er dens høje følsomhed over for baseline ændringer.
Der er tre stadier i protokollen, der er afgørende for den samlede succes. Vellykket injektion af Liberase enzym i galdegangen bestemmer ikke blot den kvantitative succes af isolations proceduren, men også påvirker kvaliteten af de isolerede Holme. Unoppustet pancreata kan resultere i mangel på nogle vigtige metaboliske reaktioner i de isolerede Holme. For det andet, lastning af farvestof/udtrykket af sensoren definerer signal-til-støj forholdet af time-lapse optagelse. Signaler er fraværende eller svækket i overb…
The authors have nothing to disclose.
AH var en modtager af en Diabetes UK PhD Studentship, EV blev støttet af OXION-Wellcome Trust træningsprogram, AIT afholdt en Oxford biomedicinsk Forskningsråd postdoc stipendium.
40x/1.3 objective | |||
Axiovert 200 microscope | |||
emission | |||
Excitation | |||
Fetal bovine serum | Sigma-Аldrich | F7524-500ML | |
Fluo4 | ThermoFisher (Life Technologies) | F14201 | |
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
Hanks' solution | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | ||
Liberase | Sigma-Аldrich | 5401020001 | |
penicillin/streptomycin | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
RPMI medium | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |