Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Abstract

Pancreatic Islet hormonen reguleren bloedglucose homeostase. Veranderingen in bloedglucose induceren oscillaties van cytosolische calcium in de cellen van de eiland alvleesklier die leiden tot afscheiding van drie belangrijke hormonen: insuline (uit β-cellen), glucagon (α-cellen) en Somatostatine (δ-cellen). β-cellen, die de meerderheid van de eiland cellen vormen en elektrisch aan elkaar zijn gekoppeld, reageren als één enkele entiteit op de glucose stimulus. De prikkelbaarheid van de kleine subpopulaties, α-cellen en δ-cellen (die ongeveer 20% (30%) en 4% (10%) van de totale celaantallen van knaagdieren¹ (menselijk²) is minder voorspelbaar en daarom van bijzonder belang.

Calcium sensoren worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het geïsoleerde eilandje. Het eilandje of een groep eilandjes wordt vervolgens geïmmobiliseerd en afgebeeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De keuze van de Imaging-modus is tussen een hogere doorvoer (breed veld) en een betere ruimtelijke resolutie (confocale). Conventioneel, laser scanning confocale microscopie wordt gebruikt voorbeeld vormende weefsel, als het biedt de beste scheiding van het signaal tussen de naburige cellen. Een breed-veld systeem kan ook worden gebruikt, als het contaminerende signaal van de dominante populatie van β-cellen wordt geminimaliseerd.

Zodra de calcium dynamiek in reactie op specifieke prikkels is geregistreerd, worden de gegevens uitgedrukt in numerieke vorm als fluorescentie intensiteit versus tijd, genormaliseerd naar de initiële fluorescentie en baseline-gecorrigeerd, om de effecten te verwijderen die verband houden met het bleken van de de. Veranderingen in de Spike frequentie of gedeeltelijke oppervlakte onder de curve (pAUC) worden berekend versus tijd, om de waargenomen effecten te kwantificeren. pauc is gevoeliger en behoorlijk robuust, terwijl de stekelige frequentie meer informatie biedt over het mechanisme van calcium toename.

Secundaire subpopulaties van cellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van functionele reacties op markerings verbindingen, zoals adrenaline en ghrelin, die veranderingen in cytosolische calcium veroorzaken in een specifieke populatie van eiland cellen.

Introduction

Het doel van de methode is om real-time veranderingen in cytosolische calciumconcentratie ([CA^{2 +}]_CYT) in kleine subpopulaties van eiland cellen van de alvleesklier te beeld. Dit maakt het onthullen van de mechanismen voor de secretie van hormonen in deze cellen, onthullen details over de cross-talk tussen verschillende celtypen en, potentieel, de invoering van een populationeel dimensie in de grotere afbeelding van eilandje signalering.

Islets bestaan uit verschillende celtypen. Naast de meer bekende insuline-afscheidende β-cellen, zijn er ten minste twee subpopulaties die ook kritisch zijn in het reguleren van bloedglucose³. α-cellen (die ongeveer 17% van de eiland cellen vormen) scheiden glucagon wanneer bloedglucose te laag wordt, wat signalen voor het vrijkomen van glucose in de bloedbaan van depots in de lever. Overmatige glucagon spiegels (hyperglucagonemie) en verminderde controle van glucagon-afgifte begeleiden (en, technisch, kunnen bijdragen aan) de prediabetische aandoening van verminderde insulinegevoeligheid⁴. δ-cellen (ongeveer 2%) afscheiden Somatostatine in reactie op verhoging van de glucose. Dit alomtegenwoordige peptide hormoon is waarschijnlijk aanwezig bij hoge concentraties in de nabijheid van α-en β-cellen binnen eilandjes, die een sterke G_i receptor-gemedieerde verzachtende werking op zowel glucagon als insuline secretie heeft.

α-cellen en δ-cellen delen een groot deel van de glucose-sensing machines met hun naaste afstamming verwanten, β-cellen. Alle drie de cellen typen zijn uitgerust met ATP-gevoelige K⁺ kanalen, uitgebreide metabole sensoren⁵ die het potentieel van de plasma membraan van deze prikkelbaar cellen controleren. Tegelijkertijd wordt de secretie van insuline, Somatostatine en glucagon anders gereguleerd door glucose. Beeldvorming van CA^{2 +} dynamiek in de twee kleine subpopulaties van eiland cellen kan daarom een inzicht geven in de cross-talk tussen bloedglucose en eilandje secretoire output.

Vroege pogingen om de prikkelbaarheid van α-en δ-cellen te monitoren met behulp van Patch-clamp elektrofysiologie werden al snel gevolgd door beeldvorming van CA^{2 +} in enkelvoudige α-en δ-cellen. De identiteit van cellen in deze experimenten werd geverifieerd via een achteraf-kleuring met anti-glucagon-of anti-Somatostatine-antilichamen. Deze inspanningen werden vaak gehinderd door de bevinding dat de cellen van het eiland zich heel anders gedragen binnen het eilandje en als alleenstaande cellen. Hoewel β-cellen de belangrijkste weldoeners van de eiland regeling lijken te zijn (vanwege hun overweldigende meerderheid die ten grondslag ligt aan hun sterke elektrische koppeling), was de belangrijkste discrepantie verrassend in α-cellen te vinden. Binnen het ongeschonden eilandje worden deze cellen voortdurend en aanhoudend geactiveerd bij lage glucose, wat alleen geldt voor ongeveer 7% van de enkelvoudige verspreide α-cellen⁶. Het rapporteren van de activiteit van α-en δ-cellen binnen intacte eilandjes wordt daarom verondersteld een nauwere benadering van de in vivo omstandigheden te vormen.

Over het algemeen zijn er twee manieren om ca^{2 +} Dynamics specifiek van de α-cel-of δ-celsubpopulaties te rapporteren: (i) een genetisch gecodeerde CA^{2 +} -sensor uitdrukken via een Weefselspecifieke promotor of (II) het gebruik van marker verbindingen. De elegantere, vroegere aanpak voegt het aanzienlijke voordeel van echte 3D-beeldvorming toe en bestudeert daarom de celverdeling binnen het eilandje. Het kan echter niet worden toegepast voor intact menselijk eilandje materiaal. Een andere potentiële zorg is de “ledigheid” van de organisator, met name wanneer de β-/α-Celtransdifferentiatie of α-celrespons op hoge glucose is uitgevoerd. Deze laatste benadering kan worden gebruikt met vers geïsoleerd weefsel, waaronder menselijke monsters of gekweekte eilandjes. De gegevens worden echter uitsluitend verzameld van de perifere laag van eiland cellen, zoals het leveren van de kleurstof/marker molecuul in diepere lagen zonder wijziging van de Islet architectuur is uitdagend. Een onverwacht voordeel van deze laatste benadering is de compatibiliteit met Wide-Field Imaging mode, waardoor de experimenten kunnen worden geschaald naar gelijktijdige beeldvorming van tientallen of honderden eilandjes (d.w.z. duizenden tot tienduizenden cellen).

Calcium wordt in vivo met behulp van genetisch gecodeerde gcamp⁷ (of pericam⁸) familie sensoren, die varianten van circulair permutated groen fluorescerende eiwit (GFP) gesmolten aan de calcium-bindende proteïne Calmoduline en de doel volgorde, M13 fragment van myosin lichte keten kinase^7,9. Gcamps hebben uitstekende signaal-ruis verhoudingen in het bereik van nanomolair CA^{2 +} concentraties en een hoge 2-Fobe dwarsdoorsnede, wat ze een ideale keuze maakt voor in vivo werk^10,11. Het uitdagende aspect van het gebruik van recombinant sensoren is hun levering in de cellen. Heterologeuze expressie vereist het gebruik van een virale vector en multi-hour ex vivo culturing, die vaak bezorgdheid oproept over mogelijke de-differentiatie of verslechtering van de celfuncties. Hoewel Muismodellen die zijn ontworpen om GCaMP te uiten dit probleem aanpakken, voegen ze nieuwe uitdagingen toe door de doorlooptijd substantieel te verhogen en het werk te beperken tot een niet-menselijk model. Zeer hoge gevoeligheid voor veranderingen van intracellulaire pH is een andere nadelige kant van eiwit-gebaseerde sensoren¹², dat is echter minder een probleem voor sensing oscillerende signalen, zoals CA^{2 +}.

Het voordeel van aftrap bare kleurstoffen (zoals groen fluorescerende Fluo4) is dat ze binnen ongeveer een uur in vers geïsoleerd weefsel kunnen worden geladen. Voorspelbare, te onderscheppen kleurstoffen hebben lagere signaal-ruis verhoudingen en (veel) lagere foto stabiliteit dan hun recombinante tegenhangers. We kunnen niet bevestigen¹³ de meldingen van toxiciteit van de te onderscheppen kleurstoffen¹⁴, echter, kleurstof overbelasting is een frequent probleem.

Rode recombinant CA^{2 +} sensoren op basis van circulaire permutatie zijn snel in ontwikkeling sinds 2011¹⁵, en de meest recente ontwikkelingen presenteren een sterke concurrentie voor gcamps¹⁶ voor weefsel beeldvorming, gezien een hogere diepte van penetratie van rood licht. In de handel verkrijgbare rode, te onderscheppen kleurstoffen kunnen betrouwbaar worden gebruikt voor eencellige beeldvorming, maar op weefselniveau kan het niet goed concurreren met de groene analogen.

Er is schijnbaar zeer weinig keuze van Imaging technologie voor experimenten in weefsel waar out-of-focus licht een kritisch probleem wordt. Het confocale systeem biedt aanvaardbare eencellige resolutie door annulering van het out-of-focus licht met enige doelstelling op de NA boven 0,3 (voor het geval van GCaMP6) of 0,8 (aftrap bare kleurstof). In technische zin kan een conventionele confocale Microscoop worden gebruikt voor gelijktijdige beeldvorming van [ca.^{2 +}]_CYT uit honderden (gcamp) of tientallen eilandjes (trappelijke kleurstof). Het enige realistische alternatief voor confocale modus in het geval van 3D-expressie van de sensor in weefsel is misschien licht-Sheet microscopie.

Dingen zijn iets anders voor het geval wanneer de sensor wordt uitgedrukt in de perifere laag van cellen in het eilandje weefsel. Voor heldere recombinant sensoren die een levendig intracellulaire expressie patroon hebben, kan het gebruik van een Wide-Field Imaging-modus met een lage-NA-doelstelling voldoende kwaliteit bieden en de onderzoeker belonen met een substantiële toename van het gezichtsveld en daarmee de Doorvoer. Een breed-veld systeem biedt een slechtere ruimtelijke resolutie, omdat het out-of-focus licht niet wordt geannuleerd; Daarom is Imaging weefsel met High-NA (lage scherptediepte) doelstellingen minder informatief, omdat het eencellige signaal sterk verontreinigd is door naburige cellen. De verontreiniging is veel kleiner voor de lage-NA (hoge scherptediepte) doelstellingen.

Er zijn echter taken waarvoor hoge doorvoer en/of samplingfrequentie een belangrijk voordeel worden. α-en δ-cellen vertonen een aanzienlijke heterogeniteit, die een vraag naar hoge steekproefgroottes creëert om de bijdrage van de subpopulaties te onthullen. Beeldvorming in brede velden is snel en gevoeliger, met een grote industriële schaal met een groot gezichtsveld voor het weergeven van honderden (GCaMP) of TENS (Fluo4) van eilandjes op dezelfde signaal-ruis verhouding als de confocale experimenten op tien of een enkel eilandje. Dit verschil in doorvoer maakt het Wide-Field-systeem voordelig voor populationele beeldvorming met een resolutie met één cel, wat vooral cruciaal kan zijn voor kleine subpopulaties zoals de δ-cel één. Evenzo, pogingen om elektrische activiteit te reconstrueren van CA^{2 +} stekelige¹⁷ zou profiteren van de hogere samplefrequentie geboden door een Wide-veld Imaging mode. Tegelijkertijd vereisen verschillende “niche”-problemen zoals de activiteit van de alvleesklier α-cellen bij stimulatie van de dominante β-cel subpopulatie, het gebruik van een confocale systeem. Een factor die van invloed is op de beslissing naar de confocale modus is de aanwezigheid van een substantieel verontreinigend signaal van de β-cel subpopulatie.

Hoewel het gebruik van hormoonspecifieke antilichaam kleuring om de identiteit van de cellen te verifiëren na de Imaging-experimenten nog steeds een optie is, kunnen kleine celsubpopulaties worden geïdentificeerd met behulp van functionele marker verbindingen, zoals adrenaline en ghreline die werden aangetoond dat ze selectief de CA^{2 +} -dynamiek in α-¹⁸ -en δ-cellen^19,20, respectievelijk hebben gestimuleerd.

De analyse van time-lapse Imaging data is bedoeld om informatie te verschaffen die verder gaat dan triviale farmacologie, zoals populationele heterogeniteit, correlatie en interactie van verschillende signalen. Conventioneel worden Imaging gegevens geanalyseerd als intensiteit versus tijd en genormaliseerd naar de initiële fluorescentie (F/F₀). Baseline correctie is vaak nodig, als gevolg van het bleken van het de signaal of verontreiniging door veranderingen in autofluorescentie of pH (meestal geïnduceerd door millimolaire spiegels van glucose¹²). CA^{2 +} gegevens kunnen op veel verschillende manieren worden geanalyseerd, maar drie belangrijke trends zijn het meten van veranderingen in de Spike frequentie, de plateau breuk of het gebied onder de curve, berekend versus tijd. We vonden de laatste aanpak voordelig, vooral in toepassing op zwaar ondergesamplede confocale gegevens. Het voordeel van de pAUC metriek is de gevoeligheid voor beide veranderingen in signaalfrequentie en amplitude, terwijl het berekenen van de frequentie vereist een aanzienlijk aantal oscillaties²¹, dat is moeilijk te bereiken met behulp van conventionele beeldvorming. De beperkende factor van de pAUC-analyse is de hoge gevoeligheid voor Baseline veranderingen.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn ontwikkeld in overeenstemming met de wet op de dieren (wetenschappelijke procedures) van het Verenigd Koninkrijk (1986) en de ethische richtlijnen van de Universiteit van Oxford. 1. Isoleer muizen pancreas eilandjes Bereid het kweekmedium en de isolatie oplossing voor. Make-up van de cultuurmedium: RMPI1640 (Zie tabel van de materialen), aangevuld met 10% van foetaal kalf serum, 100 eenheden/ml penicillaire, 100 μg/ml strep…

Representative Results

Islets kunnen vrij goed worden geladen met de te onderscheppen kleurstoffen (Figuur 1A), tenzij de lipide samenstelling van het membraan is aangetast (bijv. door chronische blootstelling aan vetzuren). De menselijke adenovirus type 5 (Ad5) vector is ook gericht op alle eiland cellen (Figuur 1B). Er kunnen zich problemen voordoen wanneer meer dan één recombinant sensor in dezelfde cel wordt uitgedrukt. Bovendien zijn eilandjes …

Discussion

Er zijn drie fasen in het protocol die essentieel zijn voor het algehele succes. Succesvolle injectie van het Liberase-enzym in het galkanaal bepaalt niet alleen het kwantitatieve succes van de isolatie procedure, maar beïnvloedt ook de kwaliteit van de geïsoleerde eilandjes. Niet-opgeblazen pancreata kan resulteren in het ontbreken van een aantal belangrijke metabole reacties in de geïsoleerde eilandjes. Ten tweede definieert het laden van de kleurstof/de expressie van de sensor de signaal-ruis verhouding van de time…

Materials

40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum	Sigma-Аldrich	F7524-500ML
Fluo4	ThermoFisher (Life Technologies)	F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector	Vector Biolabs	1910
Hanks' solution	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase	Sigma-Аldrich	5401020001
penicillin/streptomycin	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	15140122
RPMI medium	ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)	61870044
Zeiss LSM510-META confocal system	Carl Zeiss