माउस अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की उपआबादी में इमेजिंग कैल्शियम गतिशीलता
Summary
यहां, हम विषम कोशिका आबादी में कैल्शियम गतिशीलता की मात्रा और मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जैसे अग्नाशय आइलेट कोशिकाएं। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को आइलेट के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में वितरित किया जाता है, जिसे तब स्थिर और इमेजकिया जाता है, और फ्लोरेसेंस तीव्रता की गतिशीलता का प्रति-सेल विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
अग्नाशय आइलेट हार्मोन रक्त ग्लूकोज होमोस्टोसिस को विनियमित करते हैं। रक्त ग्लूकोज में परिवर्तन अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम के दोलनों को प्रेरित करता है जो तीन मुख्य हार्मोन के स्राव को ट्रिगर करता है: इंसुलिन (कोशिकाओं से), ग्लूकागन (α-कोशिकाओं) और सोमाटोस्टैटिन (कोशिकाओं)। कोशिकाएं, जो आइलेट कोशिकाओं के बहुमत को बनाती हैं और विद्युत रूप से एक दूसरे के साथ मिलकर होती हैं, ग्लूकोज उत्तेजना को एक एकल इकाई के रूप में प्रतिक्रिया देती हैं। मामूली उपआबादी, α-कोशिकाओं और कोशिकाओं की स्थिरता (लगभग 20% (30%) और 4% (10%) कुल कृंतक1 (मानव2)आइलेट सेल संख्या में से क्रमशः कम उम्मीद के मुताबिक है और इसलिए विशेष रुचि है।
कैल्शियम सेंसर को अलग आइलेट के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में वितरित किया जाता है। आइलेट या आइलेट्स के एक समूह को तब एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्थिर और चित्रित किया जाता है। इमेजिंग मोड का चुनाव उच्च थ्रूपुट (वाइड-फील्ड) और बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन (कॉन्फोकल) के बीच है। परंपरागत रूप से, लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग ऊतक के लिए किया जाता है, क्योंकि यह पड़ोसी कोशिकाओं के बीच संकेत का सबसे अच्छा पृथक्करण प्रदान करता है। एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली का भी उपयोग किया जा सकता है, अगर कोशिकाओं की हावी आबादी से दूषित संकेत को कम किया जाता है।
एक बार विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में कैल्शियम गतिशीलता दर्ज की गई है, डेटा फ्लोरेसेंस तीव्रता बनाम समय के रूप में संख्यात्मक रूप में व्यक्त कर रहे हैं, प्रारंभिक फ्लोरेसेंस और बेसलाइन को सही करने के लिए सामान्यीकृत, के ब्लीचिंग से जुड़े प्रभावों को दूर करने के लिए फ्लोरोफोर। संगति (pAUC) के तहत स्पाइक आवृत्ति या आंशिक क्षेत्र में परिवर्तन की गणना की जाती है बनाम समय, मनाया प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने के लिए । PAUC अधिक संवेदनशील और काफी मजबूत है जबकि स्पाइकिंग आवृत्ति कैल्शियम वृद्धि के तंत्र के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करता है ।
माइनर सेल उपआबादी को मार्कर यौगिकों, जैसे एड्रेनालाईन और घरेलिन के कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके पहचाना जा सकता है, जो आइलेट कोशिकाओं की एक विशिष्ट आबादी में साइटोसोलिक कैल्शियम में परिवर्तन को प्रेरित करते हैं।
Introduction
विधि का उद्देश्य अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की मामूली उपआबादी में साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता ([सीए2 +]साइट)में वास्तविक समय में परिवर्तन की छवि बनाना है। यह इन कोशिकाओं में हार्मोन स्राव को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को उजागर करने की अनुमति देता है, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच क्रॉस-टॉक के बारे में विवरण प्रकट करता है और संभावित रूप से आइलेट सिग्नलिंग की बड़ी तस्वीर में एक जनसंख्या आयाम पेश करता है।
आइलेट्स में कई सेल प्रकार होते हैं। अधिक प्रसिद्ध इंसुलिन-स्राव-कोशिकाओं के अलावा, कम से कम दो उपआबादी हैं जो रक्त ग्लूकोज3को विनियमित करने में भी महत्वपूर्ण हैं। α-कोशिकाएं (जो आइलेट कोशिकाओं के लगभग 17% बनाती हैं) ग्लूकागन को स्रावित करती हैं जब रक्त ग्लूकोज बहुत कम हो जाता है, जो जिगर में डिपो से खून में ग्लूकोज की रिहाई के लिए संकेत देता है। अत्यधिक ग्लूकागन स्तर (हाइपरग्लूकागोनेमिया) और ग्लूकागन-रिलीज के बिगड़ा नियंत्रण (और, तकनीकी रूप से, बिगड़ा इंसुलिन संवेदनशीलता4की प्रीमधुमेह स्थिति) में योगदान कर सकते हैं। कोशिकाएं (लगभग 2%) ग्लूकोज ऊंचाई के जवाब में सोमाटोस्टेटिन को स्रावित करें। यह सर्वव्यापी पेप्टाइड हार्मोन आइलेट्स के भीतर α-और’-कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में उच्च सांद्रता पर मौजूद होने की संभावना है, जिसमें ग्लूकागन और इंसुलिन स्राव दोनों पर एक मजबूत जीआई रिसेप्टर-मध्यस्थता क्षीण प्रभाव पड़ता है।
α-कोशिकाओं और कोशिकाओं को अपने करीबी वंश रिश्तेदारों, कोशिकाओं के साथ ग्लूकोज संवेदन मशीनरी का एक बड़ा हिस्सा साझा करते हैं । सभी तीन कोशिकाएं प्रकार एटीपी-संवेदनशीलK+ चैनलों, विस्तृत मेटाबोलिक सेंसर5 से लैस हैं जो इन उत्तेजनीय कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली क्षमता को नियंत्रित करती हैं। साथ ही, इंसुलिन, सोमाटोस्टेटिन और ग्लूकागन के स्राव को ग्लूकोज द्वारा अलग ढंग से विनियमित किया जाता है। आइलेट कोशिकाओं की दो छोटी उपआबादी में सीए2 + गतिशीलता की इमेजिंग इसलिए रक्त ग्लूकोज और आइलेट गुप्त उत्पादन के बीच क्रॉस-टॉक में एक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।
पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके α-और कोशिकाओं की स्थिरता की निगरानी के शुरुआती प्रयासों को जल्द ही एकल α-और कोशिकाओं में सीए2 + की इमेजिंग के बाद किया गया। इन प्रयोगों में कोशिकाओं की पहचान विरोधी ग्लूकागन या विरोधी somatostatin एंटीबॉडी के साथ एक पीछे धुंधला के माध्यम से सत्यापित किया गया था । इन प्रयासों को अक्सर खोज है कि आइलेट कोशिकाओं आइलेट के भीतर और एकल कोशिकाओं के रूप में बहुत अलग व्यवहार से बाधित थे । यद्यपि कोशिकाएं आइलेट व्यवस्था के मुख्य कल्याणकारी प्रतीत हो सकती हैं (उनके भारी बहुमत के कारण जो उनके मजबूत विद्युत युग्मन को रेखांकित करती है), मुख्य विसंगति आश्चर्यजनक रूप से, α-कोशिकाओं में पाई जाती थी। बरकरार आइलेट के भीतर, इन कोशिकाओं को लगातार और लगातार कम ग्लूकोज पर सक्रिय किया जाता है, जो केवल एक फैलाया α-कोशिकाओं6के लगभग 7% के लिए सच है । इसलिए माना जाता है कि अक्षुण्ण आइलेट्स के भीतर α-और कोशिकाओं की गतिविधि की रिपोर्ट करना विवो स्थितियों में करीब से अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है।
सामान्य तौर पर, विशेष रूप से α-सेल या”-सेल उपआबादी से सीए2 + गतिशीलता की रिपोर्ट करने के दो तरीके हैं: (i) मार्कर यौगिकों का उपयोग करके ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर या (ii) के माध्यम से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर व्यक्त करना। अधिक सुरुचिपूर्ण पूर्व दृष्टिकोण सच 3 डी इमेजिंग का पर्याप्त लाभ जोड़ता है और इसलिए आइलेट के भीतर सेल वितरण का अध्ययन करता है। हालांकि इसे बरकरार मानव आइलेट सामग्री के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। एक अन्य संभावित चिंता प्रमोटर की ‘leakiness’ है, खासकर जब उच्च ग्लूकोज के लिए α-/α-सेल प्रतिक्रिया लागू होती है। बाद के दृष्टिकोण का उपयोग मानव नमूनों या सुसंस्कृत आइलेट्स सहित ताजा अलग ऊतक के साथ किया जा सकता है। हालांकि, डेटा पूरी तरह से आइलेट कोशिकाओं की परिधीय परत से एकत्र किया जाता है, क्योंकि आइलेट वास्तुकला में फेरबदल किए बिना गहरे परतों में रंग/मार्कर अणु को वितरित करना चुनौतीपूर्ण है । उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण का एक अप्रत्याशित लाभ व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड के साथ अनुकूलता है, जो प्रयोगों को दसियों या सैकड़ों आइलेट्स (यानी, हजारों से हजारों कोशिकाओं) की एक साथ इमेजिंग करने की अनुमति देता है।
कैल्शियम को आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जीसीएएमपी7 (या पेरिकैम8)परिवार सेंसर का उपयोग करके वीवो में चित्रित किया गया है, जो गोलाकार रूप से पार किए गए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के वेरिएंट हैं जो कैल्शियम-बाध्यकारी प्रोटीन कैलोडुलिन और इसके लक्ष्य अनुक्रम, मायोसिन लाइट चेन काइनेस7,9के M13 खंड से जुड़े हैं। जीसीएएमपीएस में नैनोमोलर सीए2 + सांद्रता और एक उच्च 2-फोटॉन क्रॉस-सेक्शन की सीमा में शानदार सिग्नल-टू-शोर अनुपात है, जो उन्हें वीवो वर्क10,11में एक आदर्श विकल्प बनाता है। पुनः संयोजन सेंसर का उपयोग करने का चुनौतीपूर्ण पहलू कोशिकाओं में उनकी डिलीवरी है। हेटेरोलोगस अभिव्यक्ति के लिए वायरल वेक्टर और मल्टी-ऑवर पूर्व वीवो कत्लिंग का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, जो अक्सर संभावित डी-भेदभाव या कोशिका कार्यों के गिरावट के बारे में चिंताएं उठाती है। हालांकि माउस मॉडल पूर्व GCaMP इस समस्या का समाधान व्यक्त करने के लिए इंजीनियर, वे नेतृत्व समय काफी वृद्धि और एक गैर मानव मॉडल के लिए काम सीमित द्वारा नई चुनौतियों को जोड़ने । इंट्रासेलर पीएच के परिवर्तनों के प्रति बहुत अधिक संवेदनशीलता प्रोटीन आधारित सेंसर12का एक और प्रतिकूल पक्ष है, जो हालांकि, सीए2 +जैसे दोलन संकेतों को संवेदन के लिए एक समस्या से कम है।
ट्रैपेबल रंगों (जैसे ग्रीन फ्लोरोसेंट फ्लू4) का लाभ यह है कि उन्हें लगभग एक घंटे के भीतर हौसले से अलग ऊतक में लोड किया जा सकता है। जाहिर है, ट्रैपेबल रंगों में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और (बहुत) उनके पुनर्संयोजन समकक्षों की तुलना में कम फोटोस्थिरता होती है। हम13 ट्रैपेबल रंगों14की विषाक्तता की रिपोर्ट की पुष्टि नहीं कर सकते, हालांकि, रंग ओवरलोडिंग एक बार समस्या है ।
परिपत्र क्रमपरिवर्तन पर आधारित लाल पुनर्संयोजन सीए2 + सेंसर 201115से तेजी से विकसित हो रहे हैं, और हाल के अधिकांश घटनाक्रम लाल बत्ती के प्रवेश की उच्च गहराई को देखते हुए ऊतक इमेजिंग के लिए जीपीएस16 के लिए एक मजबूत प्रतिस्पर्धा पेश करते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लाल ट्रैपेबल रंगों का उपयोग एकल-कोशिका इमेजिंग के लिए मज़बूती से किया जा सकता है लेकिन ऊतक स्तर पर, हरे रंग के अनुरूप के साथ अच्छी तरह से प्रतिस्पर्धा नहीं कर सकते हैं।
ऊतक में प्रयोगों के लिए इमेजिंग प्रौद्योगिकी का बहुत कम विकल्प प्रतीत होता है जहां आउट-ऑफ-फोकस लाइट एक महत्वपूर्ण समस्या बन जाती है। कॉन्फोकल सिस्टम 0.3 से ऊपर एनए (GCaMP6 के मामले के लिए) या 0.8 (ट्रैपेबल डाये) पर किसी भी उद्देश्य के साथ आउट-ऑफ-फोकस लाइट को रद्द करके स्वीकार्य एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है। तकनीकी अर्थों में, एक पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग सैकड़ों (जीसीएएमपी) या दसियों आइलेट्स (ट्रैपेबल डाये) से [सीए2+]साइट के एक साथ इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। ऊतक में सेंसर की 3 डी अभिव्यक्ति के मामले में कॉन्फोकल मोड का एकमात्र यथार्थवादी विकल्प शायद लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी है।
मामले के लिए चीजें थोड़ी अलग होती हैं जब सेंसर आइलेट ऊतक के भीतर कोशिकाओं की परिधीय परत में व्यक्त किया जाता है। उज्ज्वल पुनर्संयोजन सेंसर ों के लिए जिनके पास एक ज्वलंत इंट्रासेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न है, कम-एनए उद्देश्य के साथ एक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड का उपयोग करने से पर्याप्त गुणवत्ता प्रदान की जा सकती है और शोधकर्ता को देखने के क्षेत्र में पर्याप्त वृद्धि के साथ पुरस्कृत किया जा सकता है और इसलिए प्रवाह. एक व्यापक क्षेत्र प्रणाली गरीब स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, के रूप में बाहर के ध्यान प्रकाश रद्द नहीं है; इसलिए, उच्च-एनए (क्षेत्र की कम गहराई) उद्देश्यों के साथ इमेजिंग ऊतक कम जानकारीपूर्ण है, क्योंकि एकल-सेल संकेत पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा काफी दूषित है। संदूषण कम-एनए (क्षेत्र की उच्च गहराई) उद्देश्यों के लिए बहुत छोटा है।
हालांकि, ऐसे कार्य हैं जिनके लिए उच्च थ्रूपुट और/या नमूना दर एक महत्वपूर्ण लाभ बन जाती है । α-और कोशिकाएं पर्याप्त विषमता प्रदर्शित करती हैं, जो उपआबादी के योगदान को प्रकट करने के लिए उच्च नमूना आकार की मांग पैदा करती है। वाइड-फील्ड इमेजिंग तेज और अधिक संवेदनशील है, जिसमें औद्योगिक पैमाने पर बड़े क्षेत्र-दृश्य प्रणाली इमेजिंग सैकड़ों (GCaMP) या दसियों (Fluo4) आइलेट्स के साथ क्रमशः दस या एक आइलेट पर कॉन्फोकल प्रयोगों के रूप में एक ही संकेत-से-शोर अनुपात में है। थ्रूपुट में यह अंतर एक एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ जनसंख्या इमेजिंग के लिए व्यापक क्षेत्र प्रणाली को लाभप्रद बनाता है, जो छोटे उपआबादी जैसे सेल एक के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो सकता है। इसी तरह, सीए2 + स्पाइकिंग17 से विद्युत गतिविधि के पुनर्निर्माण के प्रयासों से एक व्यापक क्षेत्र इमेजिंग मोड द्वारा प्रदान की गई उच्च नमूना दर से लाभ होगा। साथ ही, हावी कोशिका उपजनसंख्या की उत्तेजना पर अग्नाशय की α-कोशिकाओं की गतिविधि जैसी कई “आला” समस्याओं को कॉन्फोकल सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता होती है। एक कारक जो कॉन्फोकल मोड की दिशा में निर्णय को प्रभावित करता है, वह है कोशिका उपजनसंख्या से पर्याप्त दूषित संकेत की उपस्थिति।
हालांकि इमेजिंग प्रयोगों के बाद कोशिकाओं की पहचान को सत्यापित करने के लिए हार्मोन-विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला का उपयोग करना अभी भी एक विकल्प है, मामूली सेल उपआबादी की पहचान कार्यात्मक मार्कर यौगिकों का उपयोग करके की जा सकती है, जैसे एड्रेनालाईन और घेलिन जिन्हें क्रमशःα-18 और कोशिकाओं19,20में सीए2 + गतिशीलता को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया था।
समय-चूक इमेजिंग डेटा के विश्लेषण का उद्देश्य विभिन्न संकेतों की जनसंख्या विषमता, सहसंबंध और बातचीत जैसे तुच्छ फार्माकोलॉजी से परे जानकारी प्रदान करना है। परंपरागत रूप से, इमेजिंग डेटा तीव्रता बनाम समय के रूप में विश्लेषण किया जाता है और प्रारंभिक फ्लोरेसेंस (एफ/एफ0)को सामान्यीकृत किया जाता है। ऑटोफ्लोरोसेंस या पीएच (आमतौर पर ग्लूकोज12के मिलीमोलर स्तर से प्रेरित) में परिवर्तन द्वारा फ्लोरोफोर सिग्नल या संदूषण की ब्लीचिंग के कारण बेसलाइन सुधार की अक्सर आवश्यकता होती है। Ca2 + डेटा कई अलग अलग तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन तीन मुख्य प्रवृत्तियों स्पाइक आवृत्ति, पठार अंश, या वक्र के तहत क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के लिए कर रहे हैं, समय बनाम गणना की। हमने बाद के दृष्टिकोण को लाभप्रद पाया, विशेष रूप से आवेदन में भारी कम नमूना कॉन्फोकल डेटा के लिए। PAUC मीट्रिक का लाभ संकेत आवृत्ति और आयाम में दोनों परिवर्तनों के प्रति इसकी संवेदनशीलता है, जबकि आवृत्ति की गणना के लिए पर्याप्त संख्या में दोलनों की आवश्यकता होती है21,जो पारंपरिक इमेजिंग का उपयोग करके प्राप्त करना कठिन है। PAUC विश्लेषण का सीमित कारक आधाररेखा परिवर्तन के लिए इसकी उच्च संवेदनशीलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में तीन चरण हैं जो समग्र सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं। पित्त वाहिनी में लिबेरेज़ एंजाइम का सफल इंजेक्शन न सिर्फ अलगाव प्रक्रिया की मात्रात्मक सफलता को निर्धारित करता है बल्कि अलग-थलग पड़े आ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
आह एक मधुमेह ब्रिटेन पीएचडी Studentship के एक प्राप्तकर्ता था, EV OXION-वेलकम ट्रस्ट प्रशिक्षण कार्यक्रम द्वारा समर्थित था, एआईटी एक ऑक्सफोर्ड बायोमेडिकल रिसर्च काउंसिल पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप आयोजित की ।
Materials
| 40x/1.3 objective | |||
| Axiovert 200 microscope | |||
| emission | |||
| Excitation | |||
| Fetal bovine serum | Sigma-Аldrich | F7524-500ML | |
| Fluo4 | ThermoFisher (Life Technologies) | F14201 | |
| GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector | Vector Biolabs | 1910 | |
| Hanks' solution | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | ||
| Liberase | Sigma-Аldrich | 5401020001 | |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 15140122 | |
| RPMI medium | ThermoFisher (GibCo, Life Technologies) | 61870044 | |
| Zeiss LSM510-META confocal system | Carl Zeiss |
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