Isolering og kvantitativ vurdering af børste celler fra mus Tracheas
Summary
Børste celler er sjældne kolinerge kemo sensoriske epiteliale celler findes i den naive mus luftrør. På grund af deres begrænsede antal, er ex vivo evaluering af deres funktionelle rolle i luftvejene immunitet og Remodeling udfordrende. Vi beskriver en metode til isolering af trakeal pensel celler ved flow cytometri.
Abstract
Tracheal børste celler er kolinerge kemo sensoriske epitelceller, der er klar til at transmittere signaler fra luftvejene lumen til immun-og nervesystemet. De er en del af en familie af chemosensoriske epitelceller, som omfatter Tuft celler i tarmslimhinden, børste celler i luftrøret, og ensomme kemo sensoriske og mikrovillous celler i næseslimhinden. Chemosensoriske celler i forskellige epiteliale rum deler centrale intracellulære markører og en kerne transkriptional signatur, men viser også signifikant transkriptional heterogenitet, sandsynligvis reflekterende af det lokale vævs miljø. Isolering af trakeal børste celler fra enkelt celle suspensioner er påkrævet for at definere funktionen af disse sjældne epiteliale celler i detaljer, men deres isolation er udfordrende, potentielt på grund af det tætte samspil mellem trakeal pensel celler og nerve afslutninger eller på grund af luftvejs-specifikke sammensætning af stramme og klæber kryds. Her beskriver vi en procedure for isolering af pensel celler fra muse trakeal epitel. Metoden er baseret på en indledende adskillelse af trakeal epitel fra submucosa, hvilket giver mulighed for en efterfølgende kortere inkubation af epitel arket med papain. Denne procedure giver en hurtig og bekvem løsning til flow cytometrisk sortering og funktionel analyse af levedygtige trakeal pensel celler.
Introduction
Pensel celler tilhører en klasse af chemosensoriske epitelceller karakteriseret ved ekspression af bitter smag receptorer og smagen receptor transduktionsmaskiner findes i smag bud celler. I modsætning til smag opløbet celler, er chemosensoriske epitelceller spredt i epitel overflader og omtales som ensomme chemosensoriske celler (SCCS) og mikrovillous celler i nasal epitel1,2, børste celler i luftrøret 3,4og Tuft celler i tarmen5,6. Epiteliale celler, der udtrykker bitter smags receptorer og den bitre smags transduktionsmaskineri, findes også i urinrøret7,8 og auditive tube9. Luftvejene børste celler har unikke funktioner i neurogene og immun luftvejs reaktioner. De er acetylcholin-producerer chemosensoriske celler, der fremkalder beskyttende respiratoriske reflekser ved aktivering med bitre forbindelser og bakterielle metabolitter som quorum-sensing stoffer10. Luftvejs børste celler er også den dominerende luftvejs epitelial kilde IL-25, som regulerer aeroallergen-fremkaldt type 2 betændelse i luftvejene3.
Karakterisering af den fulde transkriptomet af lavere luftvejs børste celler og deres reaktion på miljømæssige stimuli har været begrænset af deres lave tal i trakeal epitel og meget begrænsede tal ud over den store bronkier10. Teknikker, der anvendes til isolering af kemo sensoriske celler fra tarm epitelet har ikke givet forholdsmæssigt høje tal fra luftrøret, muligvis på grund af de intime kontakter af trakeal børste celler med nerveender10 eller andre vævsspecifikke faktorer i den respiratoriske slimhinde, såsom sammensætningen af klæber og tætte samlings proteiner. Nylige rapporter om vellykket isolering af trakeal pensel celler i højere tal for enkelt celle RNA-sekvensering analyse beskæftigede enten en 2 h inkubation med papain eller en 18 h inkubation med pronasen11,12. Da længere inkubationer med fordøjelsesenzymer kan nedsætte celle levedygtigheden og ændre den transkriptionelle profil af celler fra fordøjet væv13, dette kunne bias komparativ analyse med andre kemo sensoriske epiteliale populationer.
Her rapporterer vi en metode til isolering af trakeal pensel celler til RNA-sekvensering3. Behandling af luftrør med høj dosis dispase adskiller epitel fra submucosa. Efterfølgende fordøjelse af epitelial ark med papain giver mulighed for fremragende genopretning af denne strukturelle celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fandt, at en kombination af høj-dosis dispase behandling for 40 min efterfulgt af en kort papain behandling (30 min) giver en optimal protokol til trakeal fordøjelse og børste celle isolation. Denne kombination undgår både omfattende fordøjelse og producerer det højeste udbytte af pensel celler, sammenlignet med alternative protokoller.
Mens lunge fordøjelsen til at udtrække hæmatopoietiske celler har klassisk påberåbt sig milde fordøjelsesenzymer som kollagenase IV<sup class="…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Adam Chicoine på Brigham and Women’s Human Immunology Center flow Core for hans hjælp med flow cytometrisk sortering. Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), og K08 AI132723 (L. G. B), og af American Academy of allergi, astma, og Immunologi (AAAAI)/American Lung allergisk Luftvejssygdom Award (N.A.B.), af AAAAI Foundation Faculty Development Award (L.G.B.), af Steven og Judy Kaye Young innovators Award (N.A.B.), af Joycelyn C. Austen Fund for karriereudvikling af kvindelige lægevidenskabelige videnskabsfolk (L.G.B.), og af en generøs donation af familien Vinik (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
