Isolasjon og kvantitativ evaluering av Brush celler fra mus Tracheas
Summary
Pensel celler er sjeldne kolinerge chemosensory epitelceller funnet i naiv mus luftrøret. På grunn av sine begrensede tall, er ex vivo evaluering av deres funksjonelle rolle i luftveiene immunitet og remodeling utfordrende. Vi beskriver en metode for isolering av tracheal pensel celler ved flyt flowcytometri.
Abstract
Tracheal pensel celler er kolinerge chemosensory epitelceller klar til å overføre signaler fra luftveiene lumen til immun-og nervesystemet. De er en del av en familie av chemosensory epitelceller som inkluderer tuft celler i tarmslimhinnen, pensel celler i luftrøret, og ensom chemosensory og microvillous celler i neseslimhinnen. Chemosensory celler i forskjellige epitel rom dele nøkkel intracellulære markører og en kjerne transcriptional signatur, men også vise betydelige transcriptional heterogenitet, sannsynligvis reflektert i det lokale vevet miljøet. Isolering av tracheal pensel celler fra enkelt celle suspensjoner er nødvendig for å definere funksjonen til disse sjeldne epitelceller i detalj, men deres isolasjon er utfordrende, potensielt på grunn av tett samspill mellom tracheal pensel celler og nerve avslutninger eller på grunn av luftveis spesifikk sammensetning av stramme og adherens knutepunkter. Her beskriver vi en prosedyre for isolering av pensel celler fra mus tracheal epitel. Metoden er basert på en innledende separasjon av tracheal epitel fra submukosa, noe som åpner for en etterfølgende kortere inkubasjons av epitel arket med Papain. Denne prosedyren tilbyr en rask og praktisk løsning for flyt analytiske sortering og funksjonell analyse av levedyktige tracheal pensel celler.
Introduction
Brush celler tilhører en klasse av chemosensory epitelceller karakterisert ved uttrykk for bitter smak reseptorer og smaken reseptoren Transduction maskiner som finnes i smak knopp celler. I motsetning til smak knopp celler, er chemosensory epitelceller spredt i epitel overflater og er referert til som enslig chemosensory celler (SCCs) og microvillous celler i nese epitel1,2, pensel celler i luftrøret 3,4, og tuft celler i tarmen5,6. Epitelceller uttrykker bitter smak reseptorer og bitter smak Transduction maskiner er også funnet i urinrøret7,8 og hørbar tube9. Luftveis pensel celler har unike funksjoner i neurogenic og immun luftveis responser. De er acetylkolin-produserende chemosensory celler som fremkalle beskyttende åndedretts reflekser ved aktivering med bitre forbindelser og bakterielle metabolitter som quorum-sensing stoffer10. Luftveis pensel celler er også den dominerende luftveisepitel kilden til IL-25, som regulerer aeroallergen-elicited type 2 betennelse i luftveiene3.
Karakterisering av full transcriptome av nedre luftveis pensel celler og deres reaksjon på miljømessige stimuli er begrenset av deres lave tall i tracheal epitel og svært begrenset tall utover den store bronkiene10. Teknikker som brukes for isolering av chemosensory celler fra tarm epitel har ikke gitt proporsjonalt høye tall fra luftrøret, muligens på grunn av intime kontakter av tracheal pensel celler med nerve avslutninger10 eller andre vev-spesifikke faktorer i luftveiene mucosa som sammensetningen av adherens og tette veikryss proteiner. Nylige rapporter om vellykket isolering av tracheal pensel celler i høyere tall for enkelt celle RNA sekvensering analyse ansatt enten en 2 h inkubasjons med Papain eller en 18 h inkubasjons med pronase11,12. Siden lengre incubations med fordøyelsesenzymer kan redusere celle levedyktighet og endre transcriptional profil av celler fra fordøyd vev13, dette kan bias sammenlignende analyse med andre chemosensory epitel populasjoner.
Her rapporterer vi en metode for isolering av tracheal pensel celler for RNA sekvensering3. Behandling av luftrøret med høy dose dispase skiller epitel fra submukosa. Senere fordøyelse av epitel arket med Papain gir utmerket utvinning av denne strukturelle cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi fant at en kombinasjon av høy dose dispase behandling for 40 min etterfulgt av en kort Papain behandling (30 min) gir en optimal protokoll for tracheal fordøyelsen og pensel celle isolasjon. Denne kombinasjonen unngår omfattende fordøyelsen og gir den høyeste avkastningen av pensel celler, sammenlignet med alternative protokoller.
Mens lunge fordøyelsen å trekke blodkreft celler har klassisk lettelse på milde fordøyelsesenzymer som kollagenase IV15, isolasjo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Adam Chicoine ved Brigham og Women ‘ s Human immunologi Center Flow Core for hans hjelp med flyt analytiske sortering. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N. A. B), U19 AI095219 (N.A.B., L. G. B), og K08 AI132723 (L. G. B), og ved American Academy av allergi, astma, og immunologi (AAAAI)/American lunge allergisk Åndedretts sykdom Award (N.A.B.), av AAAAI Foundation fakultet Development Award (L.G.B.), av Steven og Judy Kaye Young innovatører Award (N.A.B.), av Joycelyn C. Austen Fund for karriereutvikling av kvinner lege forskere (L.G.B.), og av en sjenerøs donasjon av Vinik familien (L.G.B.).
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-GFP (Polyclonal goat Ig) | Abcam | cat# ab5450 | |
| APC anti-mouse CD326 (EpCAM) (G8.8) | Biolegend | cat#118214 | |
| APC Rat IgG2a, k isotype control | Biolegend | cat#400511 | |
| DAPI | Biolegend | cat#422801 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Life Technologies/Molecular Probes | cat#A-11055 | |
| Normal Goat IgG | R&D Systems | cat#AB-108-C | |
| Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11) | Biolegend | cat#103126 | |
| Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control | Biolegend | cat#400627 | |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | cat#101320 | |
| Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins | |||
| Dispase | Gibco | cat# 17105041 | |
| DNase I | Sigma | cat# 10104159001 | |
| HEPES-Tyrode’s Buffer Without Calcium (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0.4 mM NaH2PO4, 0.25% BSA, 5.5 mM Glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter | Boston BioProducts | cat# PY-912 | |
| Tyrode’s Solution (HEPES-Buffered) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 and 10 mM glucose. Prepared in 18.2 megohms water and filtered through 0.22 µm filter. ) | Boston BioProducts | cat# BSS-355 | |
| L-Cysteine | Sigma | cat# C7352 | |
| Leupeptin trifluoroacetate salt | Sigma | cat# L2023 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | cat# P3125 | |
| Propidium iodide | Sigma | cat# P4170 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| ChATBAC-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J) | The Jackson Laboratory | 7902 | |
| Equipment | |||
| LSM 800 with Airyscan confocal system on a Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Microscope | Zeiss | ||
| LSRFortessa | BD | 647465 | |
| Disposable equipment | |||
| 1.5 mL sterile tubes | Thomas Scientific | 1157C86 | |
| 5 mL Poysterene Round-bottom Tube, 12 x 75 mm style | Falcon | 14-959-1A | |
| 50 mL Polypropylene conical tube, 30 x 115 mm style | Falcon | 352098 | |
| Feather Disposable Scalpel no.12 | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Petri dish, 100 x 15 mm Style | Falcon | 351029 | |
| Sterile cell strainer, 100 μm | Fisherbrand | cat#22363549 |
References
- Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
- Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754 (2018).
- Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
- Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
- Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
- Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849 (2017).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
- Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
- Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
- Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
- Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107 (2016).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
- Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490 (2013).
- Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
- Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
- Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
- Kouzaki, H., O’Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
- Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
- Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).
