Kunstige RNA polymerase II forlængede komplekser til dissekering af co-transkriptionelle RNA-behandlings hændelser
Summary
Her beskriver vi samlingen af RNA polymerase II (pol II) langstrakte komplekser, der kun kræver korte syntetiske DNA og RNA-oligonukleotider og renset pol II. Disse komplekser er nyttige til at studere mekanismer underliggende Co-transkriptional behandling af udskrifter i forbindelse med pol II forlængelse kompleks.
Abstract
Eukaryotic mRNA syntese er en kompleks biokemisk proces, der kræver transskription af en DNA-skabelon til en forløber RNA ved multi-subunit enzym RNA polymerase II og co-transkriptional capping og splejsning af forløberen RNA til dannelse af moden mRNA. Under mRNA syntese, RNA polymerase II forlængelse kompleks er et mål for regulering af en stor samling af transkriptionsfaktorer, der styrer sin katalytiske aktivitet, samt capping, splicing, og 3 ‘-Processing enzymer, der skaber den modne mRNA. På grund af den iboende kompleksitet mRNA syntese, enklere eksperimentelle systemer muliggør isolation og undersøgelse af sine forskellige co-transkriptionelle etaper har stor nytte.
I denne artikel beskriver vi et sådant simpelt eksperimentelt system, som er egnet til at undersøge Co-transkriptional RNA-capping. Dette system er baseret på definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser samlet fra renset polymerase og kunstige transkriptionsbobler. Når disse RNA polymerase II-komplekser er immobiliseret via biotinyleret DNA, giver de et let manipulabelt værktøj til dissekering af co-transkriptional RNA-capping og-mekanismer, hvorved forlængelse af langstrakte rekrutte og regulerer capping enzym under Co-transkriptional RNA capping. Vi forventer, at dette system kan tilpasses til at studere rekruttering og/eller samling af proteiner eller protein komplekser med roller i andre stadier af mRNA modning koblet til RNA polymerase II forlængelse kompleks.
Introduction
Eukaryotic Messenger RNA (mRNA) syntese er en udførlig biokemisk proces, der involverer syntese af en ubehandlet forløber RNA ved RNA polymerase II og behandling af forløber RNA at give den modne mRNA. RNA behandling trin af capping, splicing, og polyadenylering udføres i vid udstrækning Co-transkriptivt. Pol II-elongations komplekset fungerer som et stillads, der rekruter og organiserer aktiviteterne i mange af RNA-forarbejdnings enzymerne. Derfor vil vores ultimative forståelse af, hvordan moden eukaryote mRNAs genereres, være stærkt afhængig af udviklingen af eksperimentelle systemer for at muliggøre dissektion af de biokemiske mekanismer underliggende rekruttering til forlængelse kompleks og regulering af enzymer med ansvar for Co-transkriptional capping, splicing og polyadenylering.
Ikke overraskende har det været vanskeligt at udvikle sådanne forsøgssystemer. En væsentlig hindring har været den bemærkelsesværdige kompleksitet af Pol II-transskription selv, hvor blot rekonstitution af basal transkriptionen ved pol II in vitro kræver et minimumssæt af fem generelle transskriptions Initierings faktorer: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF og TFIIH 1. Desuden kræver en rekonstituerende type reguleret pol II-transkriptionen in vitro et endnu større sæt transkriptionsfaktorer og coregulatorer. Det har således været et vigtigt mål at udvikle enklere forsøgssystemer, der muliggør rekonstitution af aktive pol II-langstrakte komplekser, der egner sig til undersøgelser af den funktionelle kobling af Pol II-transskription og RNA-behandling.
En sådan enklere metode til rekonstitution af aktive pol II-elongations komplekser har vist sig nyttig til strukturelle og biokemiske undersøgelser af langstrakt pol II og for nylig til undersøgelse af co-transkriptional RNA-behandling2,3 ,4,5. I denne artikel viser vi, hvordan pol II-elongations komplekser fremstillet af renset pol II og syntetiske transkriptions bobler kan bruges effektivt til at undersøge de mekanismer, der underliggende Co-transkriptional capping af spirende pol II-udskrifter.
Capping refererer til den kovalente tilsætning af en 5 ‘-guanosin “Cap” til 5 ‘-trifosfat enden af spirende pol II udskrifter. Hætten er vigtig for efterfølgende trin af mRNA modning, transport, oversættelse og andre processer6,7. Den fælles landbrugspolitik tilsættes sammen transkriptivt til pol II-udskrifter af et enzym, der betegnes som capping enzym. I pattedyrsceller er aktive steder, der er ansvarlige for RNA 5 ‘-trifosfatase-og bundne-transferase-aktiviteterne i capping-enzymet, indeholdt i et enkelt polypeptid8. Udjævnings enzymet rekrutteres til pol II-forlængelse gennem interaktioner med endnu ikke definerede overflader på pol II-kroppen og Rpb1 carboxy-Terminal Domain (CTD) fosforyleret på Ser5 af dets heptapeptid gentager5. I forlængelse af forlængelse katalyserer enzymet enzym tilsætning af en 5 ‘-guanosine hætte, når den spirende afskrift når en længde på mindst 18 nukleotider og er opstået fra polymerase RNA exit Channel. I det første trin af capping reaktionen hydrolyserer trifosfatase RNA 5 ‘-trifosfat til at give en 5 ‘-diphosphat. I det andet trin hydrolyseres GTP til GMP af bundne-transferase, der danner en GMP-capping enzym mellemprodukt. Endelig, bundne transferase overfører GMP til 5 ‘-difosfat enden af den spirende transkriptet til at producere hætten.
Et bemærkelsesværdigt træk ved udjævningen reaktion er, at co-transkriptional capping (dvs. capping af udskrifter forbundet med funktionelle pol II forlængelse komplekser) er langt mere effektiv end capping af frie RNA5,9. Således har et stort spørgsmål i marken været, hvordan denne dramatiske aktivering af capping opnås gennem interaktioner af capping enzym med pol II forlængelse kompleks. I denne protokol beskriver vi samlingen af aktive RNA polymerase II-forlængelse komplekser ved hjælp af kun renset RNA polymerase II og kunstige transkriptionsbobler. Disse metoder tillader oprettelse af RNA polymerase II forlængelse komplekser med transkriptioner af definerede længde og sekvens. I en nylig undersøgelse, vi brugte disse definerede RNA polymerase II forlængelse komplekser som en model for at undersøge aspekter af mekanismerne i RNA capping5. Især viste vi, at (i) capping af RNA associeret med disse forlængelse komplekser var mere end 100-fold mere effektiv end capping af frie RNA og (II) blev stimuleret af TFIIH-afhængige fosforylering af Pol II CTD. Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, kunne i princippet tilpasses til at generere substrater til at studere andre Co-transkriptionelle RNA-behandlingsreaktioner forbundet med pol II-forlængelse.
I afsnit 1 i denne protokol, kunstige forlængelse komplekser er skabt ved udglødning en syntetisk skabelon streng DNA oligonukleotid til en RNA oligonukleotid, der supplerer den 3 ‘-ende til ca 9 nukleotider af Template streng DNA. Pol II indlæses derefter på DNA: RNA duplex. Forlængelse af forlængelse-komplekset suppleres med et delvist komplementært, ikke-skabelonelt DNA-oligonukleotid, der er mærket med biotin ved 3 ‘-enden (figur 1 og figur 2a). RNA-oligonukleotid forlænges af Pol II i disse forlængede komplekser for at fremstille radioaktivt mærkede udskrifter af defineret længde og sekvens ved tilsætning af passende kombinationer af radioaktivt mærkede nukleotider. Hertil kommer, ved hjælp af en kombination af skyller til at fjerne uindarbejdet nukleotider og yderligere tilsætning af forskellige kombinationer af nukleotider, kan man “gå” Pol II til forskellige positioner langs DNA-skabelon og syntetisere RNA af definerede længder. RNA renses derefter og udsættes for elektroforese i denaturering af urea-side geler. I afsnit 2 i protokollen, kunstige forlængelse komplekser anvendes til at analysere Co-transkriptional RNA capping. Eksemplet præsenterede virkningen af TFIIH-afhængig fosforylering af Pol II CTD på Co-transkriptional RNA-capping. I dette eksperiment måler vi omfanget af co-transkriptionelle capping som en funktion af capping enzym koncentration (5, 15 og 45 ng pr. reaktion) og tid (1, 2 og 4 min).
Protocol
Representative Results
Discussion
Undersøgelser, der har til formål at dissekere hændelser koblet til pol II-forlængelse, såsom RNA-behandling og regulering af selve transskriptionen, kan i høj grad lettes ved brug af et stærkt renset enzym system. Opsætning af sådanne enzymsystemer kan være udfordrende. Promotor-afhængig transkription af Pol II kræver mindst fem generelle transkriptionsfaktorer. Det kan tage måneder at forberede og lagre disse faktorer. Derfor er den sats-begrænsende trin i denne proces er ofte blot forbereder kadre af tra…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker S. Shuman for at give den pattedyrs capping enzym cDNA. Dette arbejde blev delvist støttet af et tilskud til Stowers Institute for Medical Research fra Helen Nelsons medicinske forskningsfond ved Greater Kansas City community Foundation. Oprindelige data underliggende dette manuskript kan tilgås fra Stowers oprindelige data repository på http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.
Materials
| [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi | Perkin Elmer | NEG007H001MC | For radiolabeling RNA |
| 2x RNA loading dye | New England Biolabs | B0363S | Highly recommended. For preparing RNA during gel loading |
| 40% Bis:Acrylamide solution | Biorad | 1610144 | |
| Bovine Serum Albumin (20 mg/ml) | New England Biolabs | B9000S | |
| Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 µg | Millipore Sigma | 14-476 | Used to phosphorylate Pol II CTD |
| DNA oligonucleotides | IDT | See Table 8 for purity specifications | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Life Technologies Invitrogen | 65001 | We have also used Dynabeads M-280 streptavidin without problem but prefer MyOne Streptavidin beads because they sediment more slowly |
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | AM9516 | Highly recommended. Dyes nucleic-acid pellet blue making reactions much easier to handle |
| Hoefer SE600 standard dual cooled vertical electrophoresis system with 1 mm spacers and 15 well comb | Hoefer | SE600-15-1.5 | |
| MaXtract high density tubes (1.5 ml) | Qiagen | 129046 | Highly recommended. Contains a high density gel that forms a stable barrier between aqueous and organic phases; improves RNA yields during extractions |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Life Technologies Invitrogen | 25530049 | |
| RNA oligonucleotides | Trilink | See Table 8 for more details | |
| Yeast Inorganic Pyrophosphatase (100 units/ml) | New England Biolabs | NEBM2403S | Required only during capping reactions |
References
- Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
- Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
- Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
- Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392 (2018).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
- Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
- Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
- Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
- Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
- Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
- Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
- Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
- Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
- Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
- Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
- Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
- Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
