Identifisering og Disseksjon av diverse mus fettlagre
Summary
Adipocytter finnes i diskrete lagre og har ulike roller innenfor deres unike microenvironments. Som regionale forskjeller i adipocyte karakter og funksjon er avdekket, standardisert identifisering og isolering av lagre er avgjørende for fremme av feltet. Heri, presenterer vi en detaljert protokoll for fjerning av ulike mus fett Depot.
Abstract
Fettvev er komplekse organer med et bredt spekter av funksjoner, inkludert lagring og mobilisering av energi som svar på lokale og globale behov, frakobling av metabolisme for å generere varme, og sekresjon av adipokines å regulere hele kroppen homeostase og immunresponser. Emerging forskning er å identifisere viktige regionale forskjeller i utviklingen, molekylær, og funksjonelle profiler av adipocytter ligger i diskrete lagre i hele kroppen. Ulike egenskaper av Depot er medisinsk relevant siden metabolske sykdommer ofte demonstrere Depot-spesifikke effekter. Denne protokollen vil gi etterforskere en detaljert anatomisk Atlas og disseksjon guide for reproduserbar og nøyaktig identifisering og fjerning av ulike mus fettvev. Standardisert Disseksjon av diskrete fettlagre vil tillate detaljerte sammenligninger av deres molekylære og metabolske egenskaper og bidrag til lokale og systemiske patologisk tilstander under ulike ernæringsmessige og miljømessige forhold.
Introduction
Fettvev spille kritiske roller i hele kroppen homeostase, inkludert lagring og frigjøring av energi som svar på lokale og globale behov, termoregulering, og sekresjon av adipokines å regulere energibalansen, metabolisme og immunresponser1 , 2. adipocytter er fordelt over hele kroppen i diskrete lagre, og i noen tilfeller tjene spesialiserte roller innenfor sine microenvironments3,4,5. Historisk har studiet av fettvev sentrert på hvitt fettvev (WAT), og dens rolle i å opprettholde energi homeostase. De fleste adipocytter er fordelt over hele kroppen i subkutan og visceral WAT lagre. Egenskapene til disse lagre er viktig for differensial mottakelighet for metabolske sykdommer. Subkutan adipocytter, som ligger under huden, har vært forbundet med beskyttende metabolske effekter5. Visceral adipocytter, som omgir vitale organer og finnes i gonadal, perirenal, retroperitoneal, omental og perikard lagre, er vanligvis knyttet til metabolske forstyrrelser, inkludert type 2 diabetes og kardiovaskulær sykdom2 . Brunt fettvev (BAT) har også blitt studert grundig. Brun og brun-lignende adipocytter uttrykke frakobling protein 1 (UCP1) og spille viktige roller i adaptive termotilblivelsen og glukose homeostase6,7. Klassiske brune adipocytter finnes i interscapular BAT Depot8. Klynger av brune adipocytter er også funnet i andre steder, inkludert supraklavikulære, infra/subscapular, cervical, paravertebral og periaortic Depot8,9.
I tillegg til deres plassering i store WAT og BAT Depot, adipocytter finnes i diskrete nisjer i hele kroppen4, hvor de kan utføre spesialiserte funksjoner innenfor sine respektive microenvironments. For eksempel, benmarg fettvev (BMAT) fungerer som et lipid reservoar, er en viktig kilde til sirkulerende adiponectin, og tett samhandler med osteoblaster, osteoklaster, og blodkreft cellene10,11. Dermal adipocytter bidrar til omfattende prosesser, inkludert sår helbredelse, immunrespons, termoregulering og hårsekken vekst12,13. Videre kan epicardial adipocytter produsere flere adipokines og chemokiner som utøver lokale og systemiske effekter på utvikling og progresjon av koronar arteriesykdom14. Utvidelse av Inter/intramuskulær WAT har blitt positivt korrelert med økt adiposity, systemisk insulinresistens, og redusert muskelstyrke og mobilitet15. I tillegg popliteal adipocytter tjene som et lipid reservoar for lymfatisk ekspansjon under infeksjon16. Mens de spesifikke rollene til ulike ledd lagre er generelt ukjent, er Hoffa Depot (infrapatellar) i kneet nå antatt å bidra til patologi, inkludert fremre kne smerter og slitasjegikt17.
Mens regionale forskjeller i adipocyte karakter og funksjon er under intens studie, er feltet for tiden begrenset av mangelen på en standardisert protokoll for identifisering og Disseksjon av ulike mus lagre. Tidligere publiserte metoder har vanligvis beskrevet isolering av ett eller to bestemte lagre og mangler det nivået av detaljer som kreves for ensartet forbrukeravgift18,19. Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir en omfattende guide for de spesifikke anatomiske steder og isolasjons trinn av mange forskjellige mus fettlagre. Selv om WAT Depot er Hovedfokuset i dette manuskriptet, er det fjerning av interscapular BAT også beskrevet i detalj. Fettvev excised bruker denne protokollen kan brukes til en rekke eksperimentelle endepunkter, inkludert explant studier, histologi, og genuttrykk analyser.
Målet med dette manuskriptet er å gi undersøkere en detaljert protokoll for å tydelig og presist identifisere og isolere både fremtredende og mindre studert mus fettlagre (figur 1). Denne ressursen vil lette en mer fullstendig undersøkelse av de utviklingsmessige, molekylære og funksjonelle egenskapene til adipocytter innen ulike nisjer.
Figur 1: skjematisk fremstilling av muse fettlagre dissekert i denne protokollen. Dette bildet er tilpasset fra bagchi et al., 20184. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ettersom viktigheten av de mangfoldige molekylære og funksjonelle egenskapene til diskrete adipocyte klynger blir stadig mer anerkjent, er det avgjørende at undersøkere i felten kan identifisere og toll lagre for videre analyser. Til dags dato finnes det få protokoller for standardisert lokalisering og isolering av det brede spekteret av mus fettlagre. Tidligere publiserte metoder er fokusert primært på en eller to depot og mangler de nødvendige detaljene for ensartet identifisering og fjerning av ulike etterforsk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O.A.M. er støttet av NIH tilskudd DK062876 og DK092759; D.P.B. er støttet av University of Michigan medisinsk forsker opplæringsprogram (T32GM007863), University of Michigan Training program i organogenesen (T32HD007605), University of Michigan Rackham Merit Fellowship, og Tylenol Future Care Fellowship.
Materials
| 10% neutral buffered formalin | Fisher Scientific | 22-110-869 | |
| 24-well plates, untreated | Sigma-Aldrich | CLS3738 | |
| 70% ethanol (dilute from 95%) | Fisher Scientific | 04-355-226 | |
| Dissecting forceps with curved tips | VWR | 89259-946 | |
| Dissecting pan | Carolina Biological Supply Company | 629004 | |
| Dissecting scissors (sharp/blunt tip) | VWR | 82027-588 | |
| Gauze sponges | Vitality Medical | 2634 | Curity 4 x 4 inch gauze sponge, 12 ply |
| Handi-Pins for dissection | Carolina Biological Supply Company | 629132 | |
| Iris scissors (straight) | VWR | 470018-890 | |
| Isoflurane | VetOne | 501017 | |
| Scalpel | VWR | 100499-578 | Feather scalpel handle with blade, disposable |
References
- Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocyte lineages: tracing back the origins of fat. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (3), 340-351 (2014).
- Bagchi, D. P., Forss, I., Mandrup, S., MacDougald, O. A. SnapShot: Niche Determines Adipocyte Character I. Cell Metabolism. 27 (1), 264-264 (2018).
- Tchkonia, T., et al. Mechanisms and metabolic implications of regional differences among fat depots. Cell Metabolism. 17 (5), 644-656 (2013).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Frontini, A., Cinti, S. Distribution and development of brown adipocytes in the murine and human adipose organ. Cell Metabolism. 11 (4), 253-256 (2010).
- Zhang, F., et al. An Adipose Tissue Atlas: An Image-Guided Identification of Human-like BAT and Beige Depots in Rodents. Cell Metabolism. 27, 252-262 (2018).
- Sanchez-Gurmaches, J., Guertin, D. A. Adipocytes arise from multiple lineages that are heterogeneously and dynamically distributed. Nature Communications. 5, 4099 (2014).
- Li, Z., Hardij, J., Bagchi, D. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Development, regulation, metabolism and function of bone marrow adipose tissues. Bone. 110, 134-140 (2018).
- Scheller, E. L., Cawthorn, W. P., Burr, A. A., Horowitz, M. C., MacDougald, O. A. Marrow Adipose Tissue: Trimming the Fat. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (6), 392-403 (2016).
- Alexander, C. M., et al. Dermal white adipose tissue: a new component of the thermogenic response. The Journal of Lipid Research. 56 (11), 2061-2069 (2015).
- Kruglikov, I. L., Scherer, P. E. Dermal Adipocytes: From Irrelevance to Metabolic Targets?. Trends in Endocrinology & Metabolism. 27 (1), 1-10 (2016).
- Iacobellis, G. Local and systemic effects of the multifaceted epicardial adipose tissue depot. Nature Reviews Endocrinology. 11 (6), 363-371 (2015).
- Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular Fat: A Review of the Consequences and Causes. International Journal of Endocrinology. 2014, 1-11 (2014).
- Pond, C. M. Adipose tissue and the immune system. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 17-30 (2005).
- Kloppenburg, A. I. -. F. M. An emerging player in knee osteoarthritis: the infrapatellar fat pad. Arthritis Research & Therapy. 15 (225), 1-9 (2013).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (94), e52174 (2014).
- Casteilla, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods in Molecular Biology. 155, 1-22 (2008).
- de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
- Parlee, S. D., Lentz, S. I., Mori, H., MacDougald, O. A. Quantifying size and number of adipocytes in adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 93-122 (2014).
- Scheller, E. L., et al. Region-specific variation in the properties of skeletal adipocytes reveals regulated and constitutive marrow adipose tissues. Nature Communications. 6, 7808 (2015).
- Scheller, E. L., et al. Use of osmium tetroxide staining with microcomputerized tomography to visualize and quantify bone marrow adipose tissue in vivo. Methods in Enzymology. 537, 123-139 (2014).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), e71084 (2013).
- Pagano, A. F., et al. Muscle Regeneration with Intermuscular Adipose Tissue (IMAT) Accumulation Is Modulated by Mechanical Constraints. PLoS One. 10 (12), e0144230 (2015).
- Khan, I. M., et al. Intermuscular and perimuscular fat expansion in obesity correlates with skeletal muscle T cell and macrophage infiltration and insulin resistance. International Journal of Obesity. 39 (11), 1607-1618 (2015).
- Sulston, R. J., et al. Increased Circulating Adiponectin in Response to Thiazolidinediones: Investigating the Role of Bone Marrow Adipose Tissue. Frontiers in Endocrinology. 7, 128 (2016).
