Collection de tissus de chauves-souris pour -Analyses d'omics et culture cellulaire primaire
Summary
Il s’agit d’un protocole pour la préparation optimale des tissus pour les analyses génomiques, transcriptomiques et protéomiques des chauves-souris capturées à l’état sauvage. Il comprend des protocoles pour la capture et la dissection des chauves-souris, la préservation des tissus et la culture cellulaire du tissu de chauve-souris.
Abstract
À mesure que les technologies de séquençage à haut débit progressent, des méthodes normalisées d’acquisition et de préservation de tissus de haute qualité permettent d’étendre ces méthodes aux organismes non modèles. Une série de protocoles visant à optimiser la collecte des tissus chez les chauves-souris a été mise au point pour une série d’approches de séquençage à haut débit. Il s’agit de protocoles pour la capture des chauves-souris, de données démographiques souhaitées à recueillir pour chaque chauve-souris et de méthodes optimisées pour minimiser le stress sur une chauve-souris pendant la collecte des tissus. Plus précisément décrits sont des méthodes pour la collecte et le traitement des tissus pour obtenir (i) l’ADN pour les analyses génomiques de poids moléculaire élevé, (ii) l’ARN pour les transcriptomes spécifiques aux tissus, et (iii) les protéines pour les analyses de niveau protéomique. Enfin, également décrit est une méthode pour éviter l’échantillonnage mortel en créant des cultures cellulaires primaires viables à partir de clips d’ailes. Une motivation centrale de ces méthodes est de maximiser la quantité de données moléculaires et morphologiques potentielles pour chaque chauve-souris et de suggérer des moyens optimaux pour préserver les tissus afin qu’ils conservent leur valeur au fur et à mesure que de nouvelles méthodes se développent à l’avenir. Cette normalisation est devenue particulièrement importante à mesure que des initiatives visant à séquencer des génomes d’espèces sans chromosome et sans erreur ont vu le jour, dans lesquelles de multiples parties scientifiques sont à l’origine du séquençage de différents génomes taxonomiques. Groupes. Les protocoles décrits ci-dessus définissent les méthodes idéales de collecte et de préservation des tissus pour Bat1K, le consortium qui séquence les génomes de chaque espèce de chauve-souris.
Introduction
Les méthodes de séquençage à haut débit (HTS) ont rapidement progressé en efficacité et ont diminué en coût, et il est maintenant possible d’étendre ces approches à des centaines ou des milliers d’échantillons. Les connaissances obtenues par l’application de ces technologies ont d’énormes impacts dans de multiples disciplines scientifiques, de la biomédecine à l’évolution et à l’écologie1,2,3. Pourtant, de nombreuses applications HTS s’appuient de façon critique sur les acides nucléiques de haute qualité à partir d’une source vivante. Cette limitation est susceptible de devenir de plus en plus problématique avec le développement du séquençage de troisième génération basé sur des molécules à longue lecture4. Pour ces raisons, il est nécessaire de concentrer les efforts sur l’établissement de pratiques exemplaires pour la collecte d’échantillons de tissus frais provenant d’organismes sauvages à l’extérieur du laboratoire, ce qui maximise l’utilité du matériel et réduit le nombre d’individus qui doivent être calme.
Bat1K est un consortium international de scientifiques avec une initiative en cours pour séquencer le génome de chaque espèce de chauve-souris à l’assemblage au niveau chromosomique5. Les chauves-souris représentent 20% de la diversité des mammifères et ont des adaptations exceptionnelles qui ont des implications pour comprendre le vieillissement, l’écologie des maladies, la biologie sensorielle, et le métabolisme5,6. De nombreuses chauves-souris sont également menacées ou en voie de disparition en raison de l’exploitation humaine7 ou diminuent rapidement en raison d’agents pathogènes8,9, et le séquençage au niveau du génome est d’une grande importance pour la conservation de ces espèces. Bien que Bat1K vise actuellement à séquencer les génomes de toutes les espèces de chauves-souris, la normalisation de la collecte d’échantillons de tissus pour le séquençage génomique de haute qualité demeure un défi majeur dans la communauté des biologistes de l’organisation. En plus des données génomiques, la compréhension fonctionnelle de la diversité des adaptations des chauves-souris nécessite des analyses de transcriptome et de protéines spécifiques aux tissus, nécessitant souvent des protocoles de collecte distincts. En outre, comme pour tous les groupes taxonomiques, bien qu’une collecte et une conservation optimales des tissus soient essentielles pour obtenir des données de la plus haute qualité pour les analyses -omics, il est souvent difficile de communiquer les meilleures pratiques en raison de l’évolution rapide des technologies et plusieurs équipes de recherche travaillant de façon indépendante.
La nécessité d’adopter des pratiques exemplaires pour la recherche sur les chauves-souris est particulièrement urgente, étant donné que de nombreuses espèces de chauves-souris sont rares ou menacées. Contrairement à d’autres petits mammifères comme les rongeurs et les persévisses, les chauves-souris sont de longue durée, attribuables à des mécanismes exceptionnels de réparation de l’ADN10 et à la reproduction lente11, la plupart des espèces donnant naissance à un seul ou (dans quelques cas) deux jeunes par an. Pour ces raisons, les populations de chauves-souris peuvent être lentes à se remettre de la perturbation, et la collecte de nombreux individus dans la nature n’est ni souhaitable ni faisable. En d’autres termes, les protocoles doivent être optimisés pour obtenir la quantité maximale de données pour un seul spécimen, réduisant ainsi la nécessité de reproduire inutilement les efforts d’échantillonnage.
Ici, ce protocole se concentre spécifiquement sur les méthodes normalisées pour la collecte et l’échantillonnage du tissu de chauve-souris pour le séquençage génomique et transcriptomique et les analyses de protéines. Sa priorité absolue est de s’assurer que les tissus des chauves-souris sont recueillis de manière éthique et responsable, allant du processus de délivrance des permis pour la collecte, l’exportation de tissus à la minimisation du stress à l’animal, et les conditions d’entreposage à long terme. Des dissections élaborées ont été développées dans le but de mettre à l’épreuve l’utilité des différents matériaux collectés. Ce manuscrit fournit un guide étape par étape pour recueillir les chauves-souris d’une manière humaine qui vise à minimiser l’impact sur les populations et à maximiser la valeur scientifique. Bien que l’objectif de ce protocole soit spécifiquement utilisé chez les chauves-souris, bon nombre des étapes sont pertinentes pour d’autres taxons vertébrés, en particulier les mammifères.
Aperçu de la collection de tissus
La procédure de collecte des tissus, y compris la température de stockage et le choix de l’agent de conservation, sera déterminée par la nature des analyses en aval prévues. Cependant, il est fortement recommandé que, dans la mesure du possible, le tissu soit recueilli selon une gamme de méthodes afin de maximiser son utilité future, même si aucune analyse spécifique n’est prévue. En général, le tissu est recueilli et conservé pour des analyses ultérieures des acides nucléiques (ADN et ARN), ou des protéines. Pour chacune de ces applications, le tissu peut être conservé de façon optimale par congélation éclair directe dans l’azote liquide (LN2). Cependant, l’immersion immédiate en LN2 n’est pas toujours possible sur le terrain. À mesure que la technologie progresse, les ressources telles que les flacons spécialisés pour stocker l’ADN et l’ARN à des températures ambiantes sont de plus en plus facilement disponibles. Bien que nous n’ayons pas validé tous ces documents dans ce protocole, nous encourageons d’autres chercheurs à analyser comparativement la performance de nouveaux matériaux par rapport à ce que nous présentons ici. Nous fournissons des méthodes pour préserver idéalement les tissus pour différentes applications dans les situations où l’on ne peut pas accéder à la LN2, par exemple lorsque le transport LN2 n’est pas possible en raison de l’accès au site par petit avion en Amazonie. En outre, nous fournissons une méthode pour recueillir les tissus à partir desquels les cellules vivantes peuvent être cultivées et propagées. Ci-dessous, nous exposons les principales considérations pour la collecte de matériel pour chacune de ces fins respectives et un aperçu des méthodes de collecte est donné dans le tableau 1.
Tissu pour l’ADN
Pour tous les tissus récoltés recueillis, le support de stockage déterminera s’il peut être utilisé pour l’extraction de l’ADN standard ou à poids moléculaire élevé (HMW). HMW est nécessaire pour le séquençage à longue lecture et actuellement nécessaire pour générer des assemblages de génome de niveau chromosomique, ou un génome « standard de platine ». L’ADN de faible poids moléculaire (LMW) peut être extrait à partir de flash congelés, AllProtect (désormais appelé «solution de stabilisation des tissus»), ou même RNAlater (désormais “solution de stabilisation de l’ARN”) échantillons conservés (bien que les échantillons congelés flash restent optimales ). L’ADN isolé selon les méthodes de laboratoire standard (p. ex., colonnes de spin de membrane de gel de silice, phénol-chloroforme) peut encore produire des fragments d’ADN allant jusqu’à 20 kilobases (kb). Par conséquent, à condition qu’il y ait un rendement suffisant, cette forme d’ADN isolé peut être utilisée pour la préparation de la bibliothèque de taille d’insert unique, dans laquelle la taille de l’insert est souvent de 500 paires de base (bp), et des lectures de séquence séquencés courtes de 100 pb sont générées12. Cet ADN est particulièrement utile pour les projets ou études de « reséquençage » dans lesquels des données chromosomiques pleine longueur ne sont pas nécessaires. L’ADN HMW (10-150 kb) est plus difficile et ne peut être obtenu de façon fiable à l’aide de tissus qui ont été rapidement congelés flash dans LN2 après la récolte et maintenus à un maximum de -80 oC jusqu’à l’extraction.
Un faible poids moléculaire ou un ADN fragmenté est souvent suffisant pour les approches ciblées, y compris l’amplification génétique par PCR et le séquençage à lecture courte13. Les investigations basées sur PCR utilisant l’ADN de LMW qui ciblent seulement un ou quelques gènes ont été très instructives en comprenant l’adaptation et l’évolution moléculaire de la biologie sensorielle de chauve-souris6,14, physiologie15,phylogénétique 5,16, et la conservation17,18. La reconquête ciblée réussie de séquence de faible poids moléculaire et d’ADN fragmenté a également été démontrée pour de nombreux groupes de vertébrés, y compris les chauves-souris19. Ces méthodes sont souvent rentables et peu invasives pour la chauve-souris, car les échantillons fécaux et l’échantillonnage non létal des tissus par des écouvillons buccals ou des poinçons de biopsie des ailes sont également des moyens courants d’obtenir de l’ADN pour les analyses de faible poids moléculaire20, 21.
Cependant, la qualité dépend fortement du type de support dans lequel l’échantillon est stocké22. Après des comparaisons systématiques et quantitatives des écouvillons buccaux et des poinçons de biopsie, les poinçons de biopsie d’aile ont été montrés pour produire des niveaux uniformément plus élevés d’ADN et étaient moins stressants à la chauve-souris pendant la collection22. Ces comparaisons ont également montré que les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque le poinçon d’aile a été conservé dans la silice indicateur (c.-à-d., un type de dessiccant fait de perles de gel de silice qui change de couleur lorsque l’humidité est observée) plutôt que dans d’autres médias de stockage populaires tels que l’éthanol ou le DMSO22; bien que, d’autres médias de stockage comprenant la solution de stabilisation de tissu n’aient pas été examinés. Les poinçons d’aile peuvent également être utilisés pour cultiver des cellules fibroblastes en culture, comme dans Kacprzyk etal.23 et comme décrit ci-dessous (voir la section 6). Pour ces méthodes, l’aile ou l’uropatagium doit être étendu doucement, et un poinçon de biopsie propre, typiquement 3 mm de diamètre, devrait être employé pour obtenir l’échantillon. Cette approche ne semble causer aucun dommage durable, avec des cicatrices guérissant plus de semaines dans la plupart des cas24.
L’ADN HMW (10-150 kb) est plus difficile et n’est actuellement obtenu que de façon fiable à l’aide de tissus qui ont été rapidement congelés en LN2 après la récolte et maintenus à un maximum de -80 oC jusqu’à l’extraction. L’ADN HMW (10-150 kb) est crucial pour le séquençage de l’ADN à longue lecture et donc pour l’assemblage du génome de novo. En effet, bien que la plupart des kits commerciaux puissent être utilisés pour isoler certains ADN HMW standard, les tailles de molécules qui en résultent ne répondent souvent pas aux exigences des technologies de séquençage de troisième génération [par exemple, celles lancées par des entreprises telles que Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, et 10x Genomics, ou par le biais de méthodes d’assemblage offertes par Bionano Genomics ou Dovetail Genomics]. En tant que tel, il ya une nouvelle demande pour “ultra HMW” ADN (-150 kb). Lors de l’obtention de l’ADN ultra HMW de chauves-souris, des échantillons frais de foie, le cerveau ou le muscle sont tous appropriés, mais ceux-ci doivent être immédiatement flash congelés dans LN2 sans aucun tampon de stockage ou cryoprotecteur. Une description complète de ces étapes est au-delà de la portée du présent document, mais sont disponibles ailleurs25.
Tissu pour ARN
L’ARN est une molécule à brin unique qui est moins stable que l’ADN. Bien qu’il existe de nombreuses formes d’ARN, les analyses des -omics ont tendance à se concentrer sur l’ARNm (ARN messager) et les petits ARN (p. ex., microARN). Après la transcription, l’ARNm est épissé pour former une transcription mature qui ne contient pas d’introns et représente la partie codante des gènes/génomes. Les gènes codants représentent une infime fraction de la taille du génome (1 %-2 %), ce qui fait du ciblage de l’ARNm un moyen rentable d’obtenir des données de séquence pour les gènes. Les microARN sont une classe d’ARN qui régulent le processus de traduction de l’ARNm en protéines et sont donc d’importants effecteurs réglementaires. Les transcriptions d’ARN peuvent être séquencées individuellement, ou plus généralement pour des analyses de -omics26,27,28,29,30, dans le cadre d’un transcriptome ; c’est-à-dire le total de toutes les transcriptions d’ARN présentes dans un échantillon donné.
Le séquençage peut être effectué selon plusieurs méthodes (c.-à-d. par l’intermédiaire de l’ARN-seq à lecture courte ou du seq isoforme entier à lecture longue), permettant l’analyse de l’abondance de l’ARN et de l’utilisation de l’isoforme. Comme la quantité et la diversité des transcriptions de l’ARNm varient selon les cellules et les tissus, le séquençage de l’ARN permet d’étudier et de comparer l’expression et la régulation des gènes entre les échantillons. L’intérêt pour le séquençage des petits ARN et le séquençage isoforme entier est de plus en plus, car ces méthodes sont de plus en plus biologiquement informatives. La préparation d’échantillons de tissus pour séquencer différentes classes d’ARN peut être effectuée de la même manière que celle présentée dans ce manuscrit, avec seulement les méthodes d’extraction ultérieures différentes31,32. Enfin, parce que les transcriptomes offrent un sous-ensemble de couverture élevée du génome codant en protéines, l’ensemble de données assemblé peut être utile dans l’assemblage et l’annotation du génome, faisant de la collecte de données ARN-seq à travers une gamme de différents tissus une composante importante de la Initiative Bat1K.
Contrairement à l’ADN, l’ARN est chimiquement instable et également ciblé par les enzymes RNase, qui sont omniprésentes présents dans les lysates tissulaires comme une stratégie défensive contre les virus à base d’ARN. Pour ces raisons, la fraction d’ARN dans les cellules et les tissus commence à se dégrader peu de temps après le point d’échantillonnage et/ou d’euthanasie. La préservation de l’ARN nécessite donc des mesures pour prévenir sa dégradation. Il s’agit généralement de préserver les tissus fraîchement recueillis à 4 oC dans un agent stabilisateur tel que la solution de stabilisation de l’ARN pour inactiver les RNases naturellement présents dans les tissus, suivi s’entrelace pour un stockage à plus long terme. Comme alternative préférée, le tissu peut être congelé flash dans LN2; bien que, comme indiqué ci-dessus, le transport de LN2 sur le terrain et le maintien des niveaux pour empêcher le dégel des tissus peuvent être difficiles sur le plan logistique.
Tissu pour protéines
La composition des protéines et l’abondance relative varient d’une manière semblable à celle de l’ARN entre les cellules et les tissus; cependant, les protéines sont en moyenne plus stables que l’ARN. L’identification protéique à l’aide de la protéomique correspond généralement à une fraction de la séquence protéique, et non à l’ensemble, mais elle peut fournir des informations sur l’expression entre les tissus et caractériser les agents pathogènes présents. Comme de nombreuses séquences protéiques sont conservées chez les mammifères, les échantillons de chauves-souris pour la protéomique peuvent facilement être contaminés par des protéines humaines conservées, nécessitant des protocoles stériles (p. ex. gants, forceps) pendant la collecte. Alors que la congélation éclair dans LN2 est le meilleur moyen de prévenir la dégradation des protéines, l’utilisation de la glace sèche, -20 congélateurs C, et même la glace sont appropriés s’il n’y a pas d’autres moyens. À mesure que les températures augmentent, le risque de dégradation différentielle des protéines augmente également. Les agents stabilisateurs tels que la solution de stabilisation des tissus sont efficaces pour préserver la fraction protéique des tissus à température ambiante et conviennent à la conservation à court terme (jusqu’à une semaine) lorsque la congélation éclair n’est pas viable.
Le profil enzymatique d’un tissu donné influence directement la préservation des protéines qui s’y contancient. Les tissus à faible activité enzymatique comme le muscle peuvent préserver les profils protéiques même à des températures plus élevées dans un congélateur domestique. En revanche, le tissu hépatique est enzymatiquement réactif, et ses protéines ont des probabilités plus élevées de dégradation pendant la préparation. Le nombre croissant de protocoles pour l’obtention de profils protéomiques humains à partir d’échantillons de paraffine strucinfixe fixe en forme (FFPE) suggère que la fixation paraformaldéhyde des tissus est prometteuse pour la conservation des protéines à faible coût lorsque la congélation lors de la collecte n’est pas faisable33,34. Bien qu’elles dépendent fortement du temps et de l’état de conservation, les protéines ont été identifiées par immunohistochimie à partir de spécimens de chauves-souris conservés à l’éthanol et à l’éthanol fixés parformaline 35. Cette approche n’est pas évolutive pour l’échantillonnage de niveau protéomique, mais met en évidence le potentiel pour les tissus de chauves-souris formalin-fixes de produire des profils de protéines lorsque le flash-congélation n’est pas disponible et d’autres agents stabilisateurs sont trop coûteux.
Tissu pour la culture cellulaire
L’échantillonnage des tissus et la congélation éclair offre une quantité finie de matériel à utiliser, et une fois que le matériau est utilisé, il n’est plus disponible. Alternativement, les cultures cellulaires fournissent des cellules vivantes qui peuvent être immédiatement utilisées ou préservées pour de futures études. Les cultures facilitent également l’expansion des cellules pour augmenter le rendement lorsque les échantillons de tissus sont petits. Il est particulièrement utile dans les cas où la collecte de tissus est limitée, comme les expériences avec des espèces rares dans lesquelles l’échantillonnage non létal est essentiel et a donc de vastes implications pour la conservation. Décrit est un protocole dans lequel la culture cellulaire est possible par l’échantillonnage non létal du tissu de membrane d’aile, mais la culture est possible avec les types multiples de tissu36,37. Le protocole fourni ici sélectionne pour les cellules adhérentes. La combinaison du tissu source et des supports de croissance utilisés rend ce protocole approprié pour sélectionner et cultiver des fibroblastes, mais si désiré, d’autres protocoles peuvent être utilisés pour sélectionner pour d’autres types de cellules. Dans le cadre du projet Bat1K, on prévoit que pour les espèces rares et menacées, l’échantillonnage non létal des membranes des ailes et l’expansion des échantillons par la culture sont essentiels pour générer le volume d’ADN nécessaire pour les multiples technologies utilisées5 .
Capture de chauve-souris
Toutes les personnes qui manipulent des chauves-souris devraient être formées par un chercheur compétent en chauves-souris et vaccinées contre la rage avec une série d’injections pré-exposition. En cas de morsure, une autre série d’injections post-exposition est encore nécessaire. Les méthodes standard de capture des chauves-souris comprennent les filets de brume (figure 1) et les pièges à harpe (figure 2). Les filets de brume sont le plus couramment utilisés et idéaux pour les zones où l’activité est faible à modérée, car ils nécessitent le plus de soin pour minimiser la détresse des chauves-souris. Les petites chauves-souris sont particulièrement vulnérables et peuvent mourir du stress si elles n’ont pas tendance à le faire rapidement. Les inspections fréquentes des filets minimisent les blessures et la mortalité des chauves-souris ainsi que les dommages au filet de brume. Ce détail est important parce que la collecte appropriée des tissus exige que le tissu soit frais, et une attention inappropriée aux filets de brume dans les chauves-souris peut conduire à une mortalité inutile ou prématurée avant que le chercheur puisse traiter correctement les échantillons. Étant donné que plusieurs chauves-souris peuvent se reposer dans un piège à harpe avec un minimum de détresse, cette approche est idéale pour les zones où l’activité des chauves-souris est élevée, comme près d’une grotte ou d’un grand perchoir. Des instructions détaillées pour la capture appropriée des chauves-souris et le traitement des données pour la collecte d’informations morphologiques et démographiques sont disponibles dans les méthodes supplémentaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole discuté dans ce manuscrit décrit les meilleures pratiques d’échantillonnage pour diverses analyses moléculaires à haut débit des chauves-souris. Toutes les études réussies -omics exigent des tissus de haute qualité, mais l’échantillonnage des tissus chauves-souris, ainsi que d’autres organismes non modèles, se produit souvent dans des conditions de terrain qui ne peuvent pas être fixées aux mêmes normes que celles d’un laboratoire contrôlé. L’échantillonnage se produit souvent dans des endro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Le Centro de Ecologàa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sànchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vsquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo et Fanny Fernandez Melo pour la fabrication de tissus collecte au Pérou possible. Nous remercions également tous les membres de Grupo Jaragua et Yolanda Leon d’avoir rendu possible la collecte de tissus en République dominicaine, ainsi qu’à Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita et à tous les membres de la station de recherche biologique de La Selva au Costa Rica, pour avoir l’échantillonnage possible. Nous remercions Ella Lattenkamp et Lutz Wiegrebe pour l’accès et la collecte d’échantillons de poinçons d’aile de Phyllostomus décolorer les chauves-souris pour la génération de culture cellulaire. Les chauves-souris de couleur de Phyllostomus proviennent d’une colonie reproductrice dans le département de biologie II de l’Université Ludwig-Maximilians à Munich. L’autorisation de garder et d’élever les chauves-souris a été délivrée par le bureau vétérinaire du district de Munich. LMD, SJR, KTJD et LRY ont été financés par NSF-DEB 1442142. LMD a été financé par NSF-DEB 1838273. LRY a été financé par le NSF-PRFB 1812035. Le VCS et la DP ont été financés par un prix Max Planck Research Group et une subvention de recherche du Human Frontiers Science Program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP et KTJD ont été financés par le Conseil européen de la recherche (erC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) attribué à SJR, ECT a été financé par la subvention du Conseil européen de la recherche (ERC-2012-StG311000).
Materials
| 1.5 mL Eppendorf Safelock tubes | Fischer Scientific | 10509691 | 1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62,554,002 | 15 mL sterile tubes used during cell culture protocol |
| 2 mL cryovials | Thomas Scientific | 1154P75 | cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen |
| 3-mm biopsy punch | Medline | MIL3332 | wing biopsy punch for cell culture |
| 6 well plate | Greiner | 83,392 | Culture vessle |
| Allprotect Tissue Reagent | Qiagen | 76405 | for fecal samples; tissue stabilizing solution |
| Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber | Bio-Rad | 145-0011 | Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad |
| collagenase IV | Stemcell Technologies | 7909 | For dissociation of primary cells |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | Prevents crystalization of water during freezing of the cells. |
| DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 12491-015 | culture media |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190169 | Balanced salt solution used for washing cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Fischer Scientific | 10270106 | Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells |
| Gentamycin sulfate salt | Sigma Aldrich | G1264-250MG | Antibiotic for culture media |
| Nalgene Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0050 | Freezing container which provides 1°C/min cooling rate |
| PARAFILM | Sigma | P7793 | Wrapping tubes etc for sealing |
| Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x | Invitrogen | 15140130 | Antibiotic for culture media |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water |
| RNAlater | Thermo Fisher | AM7021 | RNA stabilizing solution |
| RNAse away | Genetech | 83931-250mL | breaks down enzymes that lead to RNA degradation |
| Silica gel | Fisher Scientific | 7631-86-9 | dessicant agent |
| TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Automated cell counter |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | Cell stain used to assess cell viability |
| trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 | For dissociation of cells during splitting |
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