מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליכי אופטימיזציה במודל האנטי-וירוס מבוסס-פלואורסצנטית כפול שכותרתו הגידול מודל באמצעות זחל דג זברה כמארחים. מודל זה הטרוגנית מבע מחקה את הרכב הרקמה של מיקרוסביבה סרטן הלבלב ב vivo ומשמש ככלי מדויק יותר להערכת תגובות סמים בהתאמה אישית zpdx (zebrafish החולה נגזר מודלים מבע).
Abstract
החולה-נגזר הגידול מבע (pdx) ו-cell נגזר הגידול מבע (cdx) הם שיטות חשובות להערכת טרום קלינית, תרופות הדרכה ומחקרים סרטן בסיסיים. דורות של מודלים PDX בעכברים מארחים מסורתיים הם לגזול זמן ועובד רק עבור חלק קטן של דגימות. לאחרונה, דג זברה pdx (zpdx) התפתחה כמערכת מארח ייחודי, עם המאפיינים של בקנה מידה קטן ויעילות גבוהה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה אופטימיזציה ליצירת מודל כפול בעלי התווית של זריחה כפולה להערכת כימותרפיה השוואתית בדגמי zPDX. תאים סרטניים ופיברותקיעות היו מועשר מרקמת סרטן הלבלב שנקטפו או קפוא בתנאי תרבות שונים. שתי קבוצות התא היו מסומנים על ידי וירוס המבטא ירוק או אדום חלבונים פלורסנט, כמו גם BCL2L1גן אנטי אפופטוזיס. התאים המוזרקים היו מעורבים מראש ומוזרק לתוך 2 הזחל בדגים שהיו לאחר מכן ב E3 בינוני שונה ב 32 ° c. מודלים מבע טופלו על ידי תרופות כימותרפיה ו/או BCL2L1 מעכב, ואת היכולות של תאי הגידול הן והפיברוביטים נחקרו בו זמנית. לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להפיק במהירות כמות גדולה של מודלים zPDX עם מיקרוסביבה גידול הטרוגנית ומספק חלון התבוננות ארוכה יותר בכמויות מדויקות יותר בהערכת היעילות של מועמדים לסמים.
Introduction
האונקולוגיה בדיוק שואפת למצוא את האסטרטגיות הטיפוליות המועילה ביותר עבור המטופל היחיד1. כיום, מודלים רבים פרה-קליניים כגון בתרבות הראשית מחוץ לעולם, בתרבות הארגונית מחוץ לחוק2, והמטופל נגזר xenografts (pdx) בעכברים לפני או אחרי תרבות ארגונית מוצעים לאבחון ולמסך/להעריך את הפוטנציאל אפשרויות טיפוליות3. Pdx מודל שנוצר על ידי ההזרקה של התאים האנושיים הראשוניים לתוך עכברים החיסונית פרוצים, הוא אחד הכלים המבטיחים ביותר עבור הקרנת תרופות אישית באונקולוגיה קלינית3,4. שלא כמו קו התאים התרבותי בתחום החוץ, מודלים PDX בדרך כלל לשמר את היושרה ואת טרוגניות של סביבת הגידול vivo, טוב יותר לחקות את המאפיינים מגוון וייחודית של חולי גידולים שונים, ולכן, עשוי לנבא את תוצאה רפואית פוטנציאלית של חולים4. עם זאת, הדור של מודלים pdx בעכברים דורש באיכות גבוהה דגימות המטופל וחודשים של זמן לאסוף תאים מספיקים ומודלים עבור ניסויים קבוצה מרובת, ואת היצירות הסלולר/גנטי של השתל מבע להיסחף מאלה של המקורי ביופסיהשל המטופלת שיעור ההצלחה של הקמת עכברים מודל PDX הוא גם נמוך, מה שמקשה להיות מיושם באופן נרחב בפרקטיקה הקלינית. עבור המטופלים שנשאו במהירות סרטן התקדמה כמו סרטן הלבלב, הם לא יכולים לקבל מידע חשוב מניסויים PDX בזמן.
בשנים האחרונות, דג זברה דווחו להיות מארחים פוטנציאליים עבור לא רק cdx (תא נגזר הגידול xenograft) מודלים, אבל גם pdx מודלים5,6,7,8,9 , 10. כבעל חיים במודל בעלי חוליות, הנמלים בעלי דמיון מספיק עם יונקים בגנטיקה ופיזיולוגיה, עם שני יתרונות משמעותיים: שקיפות קטן בגודל11. זברפיש הוא גם מאוד פוריות, ומאות הזחלים המאוזיים יכולים להיות מתקבלים תוך כמה ימים מזוג אחד של מבוגרים12. מספר מחקרים המועסקים דג זברה כדי ליצור הן מודלים הטרנסגניים ו מבע מחלות סרטן13,14. בהשוואה לעכברים xenografts, דג זברה מאפשר מעקב ברזולוציה תא בודד. כמות מסוימת של רקמות האדם הוא מסוגל לייצר מאות דג זברה מודלים pdx (zpdxs), בעוד יכול להיות מספיק רק כדי ליצור כמה עכברים pdx מודלים15,16. חוץ מזה, הזחלים דג זברה ב 2-5 dpf כבר לפתח מערכות הדם המלא איברים מטבוליים כגון כבד וכליות, אבל לא את המערכת החיסונית17, בעוד שק החלמון הנותרים הוא בינונית 3d טבעי, אידיאלי עבור הקרנת סמים, סמים בדיקות התנגדות ותצפיות הגירה לגידול6,18,19,20,21.
עם ניסיון אולטימטיבי להשתמש zPDX כפלטפורמת הקרנה/בדיקה לשימוש קליני, כאן, אנו מתארים הצעה ממוטבת עבור מודל zPDX של סרטן הלבלב, אשר מאפשר את הערכת הסמים vivo המועמד תוך זמן קצר באמצעות פחות תאים בעלויות נמוכות. לעומת ההפניות הקודמות על zpdx6,9,10, הצגנו מספר אופטימיזציות כדי להפוך את המערכת יותר ריאלי ואמין עבור אבחון מותאם אישית קליני: 1) טרום מיון תא אחר קבוצות ברקמות הגידול הראשיות וייצוב תאים ראשוניים לשבוע אחד לפני ניסויים נוספים; 2) מתייג את התאים האנושיים ומשפר את הכדאיות התאית ב-מבע באמצעות שינוי גנטי מבוסס-וירוס; 3) מיטוב מצבם של תרבות הדגים בתוספי התזונה (גלוקוז ו גלוטמין) ובטמפרטורה; 4) מכמת את תגובות הסמים של סוגי תאים שונים באופן השוואתי. כמו כן עשינו שינויים בפתרון ההזרקה על ידי הוספת מספר חומרים משלימים. בסך הכל, שיפורים אלה מספקים את האפשרות לייצר במהירות יותר מטופל כמו מבע במארחים דג זברה שיכול לשמש ככלי אמין כדי להעריך את התגובה של תרופות המועמדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הן PDX ו-CDX מודלים הם פלטפורמות חיוניות בתחום של ביולוגיה של הגידול22, ואת הצעד הקריטי של השתלת בין זנים מוצלחת היא לשפר את ההישרדות של xenograft. לאחרונה, מחקרים מסוימים הראו כי ביטוי חולף של BCL2L1 (BCL-XL) או BCL2 עשוי לשפר באופן משמעותי את הכדאיות של תאים גזע האדם מתחלקים במ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין 81402582, הקרן המדע הטבעי של שנגחאי 12DZ2295100, 14YF1400600 ו 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Recherche en cancérologie. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Recherche en cancérologie. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
