Modello Xenotrapianto eterogeneo derivato dal paziente del cancro pancreatico utilizzando larve di pesce zebra come ospiti per la valutazione comparativa del farmaco
Summary
Questo protocollo descrive le procedure di ottimizzazione in un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza basato su virus utilizzando il pesce zebra larva come ospiti. Questo modello xenotrapianto eterogeneo imita la composizione tissutale del microambiente del cancro al pancreas in vivo e funge da strumento più preciso per valutare le risposte ai farmaci in modelli personalizzati zPDX (zebrafish patient-derived xenogrft).
Abstract
Lo xenotrapianto tumorale derivato dal paziente (PDX) e lo xenotrapianto tumorale derivato dalle cellule (CDX) sono tecniche importanti per la valutazione preclinica, la guida medica e le ricerche di base sul cancro. Generazioni di modelli PDX in topi host tradizionali richiedono molto tempo e lavorano solo per una piccola parte di campioni. Recentemente, il PDX del pesce zebra (zPDX) è emerso come un sistema host unico, con le caratteristiche di piccola e alta efficienza. Qui, descriviamo una metodologia ottimizzata per la generazione di un modello di xenotrapianto tumorale a doppia fluorescenza per la valutazione chemioterapia comparativa nei modelli zPDX. Le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati arricchiti da tessuti tumorali pancreatici appena raccolti o congelati in diverse condizioni di coltura. Entrambi i gruppi cellulari sono stati etichettati dal lentivirus che esprime proteine fluorescenti verdi o rosse, così come un gene anti-apoptosi BCL2L1. Le cellule trasfette sono state pre-miscelate e co-iniettate nel pesce zebra larvale 2 dpf che sono stati poi allevati in un mezzo E3 modificato a 32 gradi centigradi. I modelli di xenotrapianto sono stati trattati con farmaci chemioterapici e/o inibitori di BCL2L1, e le vibilità di entrambe le cellule tumorali e i fibroblasti sono stati studiati simultaneamente. In sintesi, questo protocollo consente ai ricercatori di generare rapidamente una grande quantità di modelli zPDX con un microambiente tumorale eterogeneo e fornisce una finestra di osservazione più lunga e una quantificazione più precisa nella valutazione dell’efficienza dei farmaci candidati.
Introduction
L’oncologia di precisione mira a trovare le strategie terapeutiche più vantaggiose per il singolo paziente1. Attualmente, numerosi modelli preclinici come la coltura primaria in vitro, la coltura organoide in vitro2e gli xenografifti derivati dal paziente (PDX) nei topi prima o dopo la coltura organoide sono proposti per la diagnosi e per vagliare/valutare il potenziale scelte terapeutiche3. Modello PDX generato dall’iniezione di cellule tumorali primarie umane in topi immunocompromessi, è uno degli strumenti più promettenti per lo screening farmacologico personalizzato in oncologia clinica3,4. A differenza della linea cellulare coltivata in vitro, i modelli PDX di solito conservano l’integrità e l’eterogeneità dell’ambiente tumorale in vivo, imitando meglio la diversità e le caratteristiche idiosincratiche di diversi pazienti tumorali, e quindi, possono prevedere potenziale esito medico dei pazienti4. Tuttavia, la generazione di modelli PDX nei topi richiede campioni di pazienti di alta qualità e mesi di tempo per raccogliere cellule e modelli sufficienti per esperimenti multigruppo, e le composizioni cellulari/genetiche dello xenotrapianto possono derivarsi da quelle dell’originale biopsia del paziente. Anche il tasso di successo per la creazione del modello PDX dei topi è basso, rendendo difficile l’implementazione nella pratica clinica. Per i pazienti che trasportano carcini rapidamente progrediti come il cancro al pancreas, potrebbero non essere in grado di ottenere informazioni preziose dagli esperimenti PDX in tempo.
Negli ultimi anni, il pesce zebra è stato segnalato per essere potenziali host non solo per i modelli CDX (xenogrofo tumorale derivato dalla cellula), ma anche modelli PDX5,6,7,8,9, 10. Come animale modello di vertebrato, il pesce zebra presenta sufficienti somiglianze con i mammiferi sia in genetica che in fisiologia, con due vantaggi significativi: trasparenza e piccola taglia11. Il pesce zebra è anche altamente fecondità, e centinaia di larve inbred possono essere ottenute in pochi giorni da una singola coppia di adulti12. Diversi studi hanno impiegato pesci zebra per generare modelli sia transgenici che xenotrapiformi di malattie tumorali13,14. Rispetto agli xenografti di topi, gli xenografti di pesce zebra consentono il tracciamento a risoluzione a singola cellula. Una certa quantità di tessuti umani è in grado di generare centinaia di modelli PDX di pesce zebra (zPDX), mentre può essere sufficiente solo per generare un paio di topi pdX modelli15,16. Inoltre, le larve di pesce zebra a 2-5 dpf già sviluppano sistemi circolatori completi e organi metabolici come fegato e reni, ma non il sistema immunitario17, mentre il sacco del tuorlo rimanente è un mezzo 3D naturale, ideale per lo screening farmacologico, farmaco test di resistenza e osservazioni di migrazione tumorale6,18,19,20,21.
Con un ultimo tentativo di utilizzare zPDX come piattaforma di screening/test per l’uso clinico, qui, descriviamo una proposta ottimizzata per il modello zPDX del cancro al pancreas, che consente la valutazione del farmaco candidato in vivo in breve tempo utilizzando meno cellule a costi inferiori. Rispetto ai precedenti riferimenti su zPDX6,9,10, abbiamo introdotto diverse ottimizzazioni per rendere il sistema più fattibile e affidabile per la diagnosi clinica personalizzata: 1) pre-ordinamento di diverse cellule gruppi nei tessuti tumorali primari e stabilizzare le cellule primarie per una settimana prima di ulteriori esperimenti; 2) etichettare le cellule umane e migliorare la vitalità cellulare in xenotrapianto tramite modificazione genetica basata su lentivirus; 3) ottimizzare la condizione di coltura del pesce zebra sia negli integratori di nutrimento (glucosio e glutammina) che nella temperatura; 4) quantificare le risposte ai farmaci di diversi tipi di cellule in modo comparativo. Abbiamo anche apportato modifiche alla soluzione di iniezione aggiungendo diversi materiali supplementari. Complessivamente, tali miglioramenti offrono la possibilità di generare rapidamente uno xenotrapianto più simile a quello del paziente negli ospiti di pesci zebra che può essere utilizzato come strumento affidabile per valutare la risposta dei farmaci candidati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entrambi i modelli PDX e CDX sono piattaforme vitali nel campo della biologia tumorale22,e la fase critica di un trapianto interspecie di successo è quello di migliorare la sopravvivenza dello xenotrapianto. Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato che l’espressione transitoria di BCL2L1 (BCL-XL) o BCL2 può migliorare significativamente la vitalità delle cellule staminali embrionali umane negli ospiti dei topi senza influenzare le identità cellulari e i destini<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China 81402582, Natural Science Foundation of Shanghai 12D-2295100, 14YF1400600 e 18-R1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
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