Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment
Summary
Denne protokollen beskriver optimaliserings prosedyrer i en virus BAS ert dual fluorescens-merket tumor xenograft modell ved hjelp av larvestadiet sebrafisk som verter. Denne heterogene xenograft modellen etterligner vev sammensetningen av bukspyttkjertelkreft mikromiljøet in vivo og fungerer som et mer presist verktøy for å vurdere narkotika responser i personlig zPDX (sebrafisk pasient-avledet xenograft) modeller.
Abstract
Pasient-avledet tumor xenograft (PDX) og celle-avledet tumor xenograft (CDX) er viktige teknikker for prekliniske vurdering, medisinering veiledning og grunnleggende kreftforskning. Generasjoner av PDX-modeller i tradisjonelle verts mus er tidkrevende og fungerer bare for en liten andel av prøvene. Nylig har sebrafisk PDX (zPDX) dukket opp som et unikt vertssystem, med egenskapene til småskala og høy effektivitet. Her beskriver vi en optimalisert metodikk for å generere en dobbel fluorescens-merket tumor xenograft modell for sammenlignende kjemoterapi vurdering i zPDX modeller. Tumor celler og fibroblaster ble beriket av fersk høstet eller frossen kreft i bukspyttkjertelen ved ulike kultur forhold. Begge celle gruppene ble merket med lentivirus som uttrykte grønne eller røde fluorescerende proteiner, samt et anti-apoptose gen BCL2L1. De transfekterte cellene var pre-blandet og co-injisert i 2 DPF larvestadiet sebrafisk som ble så avlet i modifisert E3 medium ved 32 ° c. De xenograft modellene ble behandlet av kjemoterapi narkotika og/eller BCL2L1 inhibitor, og viabilities av både tumorceller og fibroblaster ble undersøkt samtidig. Oppsummert tillater denne protokollen forskerne å raskt generere en stor mengde zPDX modeller med en heterogen tumor mikromiljøet og gir en lengre observasjon vindu og en mer presis kvantifisering i vurderingen effektiviteten av stoffet kandidater.
Introduction
Precision onkologi tar sikte på å finne de mest fordelaktige terapeutiske strategier for individuell pasient1. For tiden er tallrike prekliniske modeller som in vitro primær kultur, in vitro organoid Culture2, og pasient-avledet XENOTRANSPLANTATER (PDX) i mus før eller etter organoid kultur foreslått for diagnostisering og til skjerm/vurdere potensialet terapeutiske valg3. PDX modell generert av injeksjon av menneskelige primær kreftceller i uimottakelig-kompromittert mus, er en av de mest lovende verktøy for personlig narkotika screening i klinisk onkologi3,4. I motsetning til den kultivert cellelinjen in vitro, beholder PDX-modellene vanligvis integriteten og heterogenitet i in vivo tumor miljø, bedre etterligne mangfoldet og idiosynkratiske karakteristikker av ulike tumor pasienter, og derfor kan forutsi potensielle medisinske utfallet av pasientene4. Generering av PDX-modeller i mus krever imidlertid høykvalitets pasientprøver og måneders tid for å samle inn tilstrekkelige celler og modeller for eksperimenter med flere grupper, og de cellulære/genetiske komposisjoner av xenograft kan drive fra de opprinnelige pasientensbiopsi. Suksessraten for å etablere mus PDX-modellen er også lav, noe som gjør det vanskelig å bli bredt implementert i klinisk praksis. For pasientene som har raskt utviklet kreft som kreft i bukspyttkjertelen, kan de ikke være i stand til å innhente verdifull informasjon fra PDX-eksperimentene i tide.
I de siste årene, sebrafisk har blitt rapportert å være potensielle verter for ikke bare CDX (Cell-avledet tumor xenograft) modeller, men også PDX modeller5,6,7,8,9, 10. som en virveldyr modell dyr, sebrafisk havner tilstrekkelige likheter med pattedyr i både genetikk og fysiologi, med to vesentlige fordeler: åpenhet og små i størrelse11. Sebrafisk er også svært fekunditet, og hundrevis av innavlet larver kan fås i løpet av få dager fra et enkelt par voksne12. Flere studier har ansatt sebrafisk å generere både transgene og xenograft modeller av kreft sykdommer13,14. Sammenlignet med mus xenotransplantater, sebrafisk xenotransplantater tillate sporing på én celle oppløsning. En viss mengde menneskelig vev er i stand til å generere hundrevis av sebrafisk PDX modeller (zPDXs), mens kan bare være tilstrekkelig til å generere et par mus PDX modeller15,16. Dessuten, sebrafisk larver på 2-5 DPF allerede utvikle komplette sirkulasjonssystemer og metabolske organer som lever og nyre, men ikke immunsystemet17, mens de resterende eggeplomme SAC er en naturlig 3D medium, ideell for narkotika screening, narkotika motstands tester og tumor migrasjon observasjoner6,18, 19,20,21.
Med et ultimate forsøk på å bruke zPDX som en plattform for screening/testing for klinisk bruk, her beskriver vi en optimalisert forslag til zPDX modell av kreft i bukspyttkjertelen, som gjør at in vivo kandidat narkotika vurdering i løpet av kort tid bruker færre celler til lavere kostnader. Sammenlignet med tidligere referanser om zPDX6,9,10, introduserte vi flere optimaliseringer for å gjøre systemet mer gjennomførbart og pålitelig for klinisk personlig diagnose: 1) forhånds sortering av annen celle grupper i den primære tumor vev og stabilisere primær celler i en uke før videre eksperimenter; 2) merking av humane celler og forbedre celle levedyktigheten i xenograft via lentivirus-basert genetisk modifisering; 3) optimalisere sebrafisk kultur tilstand i både nutriment kosttilskudd (glukose og glutamin) og temperatur; 4) kvantifisere stoffet responser av forskjellige celletyper i en komparativ måte. Vi har også gjort endringer i injeksjons løsningen ved å legge til flere supplerende materialer. Til sammen gir disse forbedringene muligheten til raskt å generere en mer tålmodig-lignende xenograft i sebrafisk verter som kan brukes som et pålitelig verktøy for å vurdere responsen fra kandidat stoffene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Både PDX og CDX-modeller er viktige plattformer innen tumor biologi22, og det kritiske trinnet i en vellykket Inter-arter transplantasjon er å forbedre overlevelsen av xenograft. Nylig har noen studier vist at forbigående uttrykk for BCL2L1 (BCL-XL) eller BCL2 kan betydelig forbedre levedyktigheten til menneskelige embryonale stamceller i mus verter uten å påvirke cellen identiteter og skjebne23 , 24 prise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina 81402582, Natural Science Foundation i Shanghai 12DZ2295100, 14YF1400600 og 18ZR1404500
Materials
| DMEM | GIBCO | C11995500BT | |
| FBS | Hyclone | sv30087.03 | |
| Y-27632 | Cliniscience | Y0503 | Rho kinase inhibitor |
| Primocin | invivogen | ant-pm-1 | an antibiotic for primary cell cultures |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Nicotinamide | Sigma | N3376 | |
| penicillin streptomycin | GIBCO | 15140122.00 | |
| phosphate buffer (PBS) | GIBCO | C10010500CP | |
| HBSS | GIBCO | 14170112.00 | |
| collagenase type IV | GIBCO | 17104019.00 | |
| hyaluronidase | Sigma | H3884 | |
| DnaseⅠ | Sigma | D5025 | |
| insulin | Sigma | I9278 | |
| b-FGF | GIBCO | PHG0264 | |
| EGF | GIBCO | PHG0314 | |
| pancreatic cancer fibroblasts inhibitor | CHI Scientific | FibrOUT | |
| 0.45 μm sterile filter | Millipore | SLHV033RB | |
| concentration column | Millipore | Millipore UFC910008 | Concentrate the virus |
| polybrene | Sigma | H9268 | |
| Hyaluronic Acid Sodium Salt | Sigma | H7630 | |
| L-glutamine | GIBCO | 21051024.00 | |
| gemcitabine | Gemzan | ||
| methylcellulose | Sigma | M0262 | |
| Navitoclax(ABT-263) | Selleck | S1001 | Bcl-xL inhibitor |
| Equipment | |||
| Microinjector | NARISHIGE | ||
| stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Confocal Microscope | LEICA | SP8 | 0.00 |
References
- Collins, D. C., Sundar, R., Lim, J. S. J., Yap, T. A. Towards Precision Medicine in the Clinic: From Biomarker Discovery to Novel Therapeutics. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 25-40 (2017).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Chen, L., et al. A zebrafish xenograft model for studying human cancer stem cells in distant metastasis and therapy response. Methods in Cell Biology. 138, 471-496 (2017).
- Gaudenzi, G., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in neuroendocrine tumors. Endocrine. 57 (2), 214-219 (2017).
- Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. Journal of Visualized Experiment. (136), (2018).
- Zhang, M., et al. Adipocyte-Derived Lipids Mediate Melanoma Progression via FATP Proteins. Cancer Discovery. 8 (8), 1006-1025 (2018).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews: Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Guo, M., et al. U0126 inhibits pancreatic cancer progression via the KRAS signaling pathway in a zebrafish xenotransplantation model. Oncology Reports. 34 (2), 699-706 (2015).
- Yao, Y., et al. Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer Research. 78 (19), 5548-5560 (2018).
- Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7 (7), 745-754 (2014).
- Zon, L. I., Peterson, R. The new age of chemical screening in zebrafish. Zebrafish. 7 (1), 1 (2010).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Developmental & Comparative Immunology. 28 (1), 9-28 (2004).
- Mercatali, L., et al. Development of a Patient-Derived Xenograft (PDX) of Breast Cancer Bone Metastasis in a Zebrafish Model. International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).
- Wu, J. Q., et al. Patient-derived xenograft in zebrafish embryos: a new platform for translational research in gastric cancer. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 160 (2017).
- Tulotta, C., et al. Imaging Cancer Angiogenesis and Metastasis in a Zebrafish Embryo Model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 239-263 (2016).
- Yao, Y., et al. Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distributions of fifteen fluorescent compounds. Disease Model& Mechanisms. , 028811 (2017).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews: Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Charo, J., et al. Bcl-2 overexpression enhances tumor-specific T-cell survival. Cancer Research. 65 (5), 2001-2008 (2005).
- Wang, X., et al. Human embryonic stem cells contribute to embryonic and extraembryonic lineages in mouse embryos upon inhibition of apoptosis. Cell Research. 28 (1), 126-129 (2018).
- Boise, L. H., et al. bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death. Cell. 74 (4), 597-608 (1993).
- Moore, J. C., et al. Single-cell imaging of normal and malignant cell engraftment into optically clear prkdc-null SCID zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 213 (12), 2575-2589 (2016).
