Monitoraggio della colonizzazione e della manutenzione batterica sull'Arabidopsis thaliana Radici in un sistema idroponico galleggiante

Summary

Qui descriviamo un test di crescita delle piante idroponica per quantificare la presenza delle specie e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il loro trasferimento in diversi ambienti di crescita.

Abstract

I batteri formano microbiomi di rizosfera complessi modellati da microbi interagenti, organismi più grandi e l’ambiente abiotico. In condizioni di laboratorio, la colonizzazione della rizosfera da batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB) può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti rispetto alle piante non colonizzate. Tuttavia, nelle impostazioni di campo, i trattamenti batterici con PGPB spesso non forniscono benefici sostanziali alle colture. Una spiegazione è che questo può essere dovuto alla perdita del PGPB durante le interazioni con microbi del suolo endogeni durante la durata della vita della pianta. Questa possibilità è stata difficile da confermare, dal momento che la maggior parte degli studi si concentra noto sulla colonizzazione iniziale piuttosto che sul mantenimento del PGPB all’interno delle comunità di rizosfera. Si ipotizza qui che l’assemblaggio, la coesistenza e il mantenimento delle comunità batteriche siano modellati da caratteristiche deterministiche del microambiente di rizosfera, e che queste interazioni possano influenzare la sopravvivenza di PGPB in ambienti nativi. Per studiare questi comportamenti, un saggio idroponico della crescita vegetale è ottimizzato utilizzando l’Arabidopsis thaliana per quantificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei batteri durante la colonizzazione iniziale delle radici delle piante e dopo il trasferimento a una crescita diversa Ambienti. La riproducibilità e l’utilità di questo sistema vengono quindi convalidate con la ben studiata PGPB Pseudomonas simiae. Per studiare come la presenza di più specie batteriche può influenzare la colonizzazione e la dinamica di manutenzione sulla radice della pianta, una comunità modello da tre ceppi batterici (un Arthrobacter, Curtobacterium, e Microbacterium specie) originariamente isolata dalla rizosfera A. thaliana. È dimostrato che la presenza di queste diverse specie batteriche può essere misurata utilizzando questo saggio idroponico di pianta-maintanence, che fornisce un’alternativa agli studi della comunità batterica basata sul sequenziamento. Studi futuri che utilizzano questo sistema possono migliorare la comprensione del comportamento batterico nei microbiomi vegetali multispecie nel tempo e nelle mutevoli condizioni ambientali.

Introduction

La distruzione delle colture da malattie batteriche e fungine comporta una riduzione della produzione alimentare e può interrompere gravemente la stabilità globale¹. Sulla base della scoperta che i microbi nei suoli soppressivi sono responsabili dell’aumento della salute delle piante^2,gli scienziati hanno chiesto se il microbioma vegetale possa essere sfruttato per sostenere la crescita delle piante modificando la presenza e l’abbondanza di particolari specie batteriche³. I batteri trovati per aiutare nella crescita o nello sviluppo delle piante sono collettivamente rilegati ai batteri che promuovono la crescita delle piante (PGPB). Più recentemente, gli studi sono passati dalla semplice identificazione di potenziali PGPB alla comprensione di come le interazioni interkingdome nel suolo, intorno alle radici o nella rizosfera (l’area che circonda direttamente e comprende la superficie della radice) possono avere un impatto pgPB attività⁴.

La colonizzazione della rizosfera da parte del PGPB può aumentare la salute o lo sviluppo di piante ospiti in risposta a diversi fattori di stress rispetto alle piante non colonizzate⁵. Tuttavia, i risultati sono spesso più variabili nelle condizioni del suolo nativo rispetto a quelli osservati nelle impostazioni strettamente controllate della serra e del laboratorio⁶. Un’ipotesi per questa differenza è che la crescita o il comportamento di PGPB può essere inibito da batteri del suolo nativo o funghi nei campi^7,8. Gli effetti benefici dei batteri di rizosfera dipendono generalmente dalla capacità dei batteri a 1) individuare e spostarsi verso la radice, 2) colonizzare la radice attraverso la formazione di biofilm e 3) interagire con la pianta o gli agenti patogeni ospiti attraverso la produzione di piccole molecole metaboliti^7,9. Ognuno di questi comportamenti di colonizzazione può essere influenzato dalla presenza e dall’attività dei microbi vicini¹⁰.

Abbiamo progettato un sistema per quantificare e visualizzare queste distinte fasi di colonizzazione batterica della rizosfera (Figura 1). Questo approccio faciliterà gli studi sul motivo per cui la manutenzione PGPB a lungo termine non viene talvolta osservata dopo il trasferimento di piante in nuovi ambienti, ad esempio durante la semina di piantine pre-inocupate. Arabidopsis thaliana come sono stati scelti come un modello vegetale a causa del suo ampio uso in studi di laboratorio, nonché gli ampi dati disponibili sulle sue interazioni microbiche¹¹. Ci sono tre fasi nel sistema: 1) A. thaliana crescita, 2) colonizzazione batterica, e 3) la manutenzione batterica (vedi Figura 1). Poiché A. thaliana è una pianta terrestre, era importante assicurarsi che non soffrisse indebitamente lo stress idrico nel sistema idroponico¹². Ispirate ai metodi utilizzati da Haney et al.¹³, le piantine vengono coltivate su rete di plastica per separare il tiro dal mezzo di crescita liquido. Questo sistema non sembra compromettere la salute e lo sviluppo dell’ospite della pianta, e migliora la crescita di A. thaliana nel liquido¹¹. Come il germoglio pianta galleggia sopra la superficie, le radici sono completamente esposti alla colonizzazione da batteri inoculati nel mezzo di crescita batterica liquida. Questo permette ai batteri di interesse di essere esaminati per la colonizzazione in sostanze nutritive che sono più favorevoli alla crescita, mentre poi spostando le condizioni per consentire alla pianta di continuare a crescere in un mezzo nutritivo progettato per sostenere la sua crescita. Entrambe le fasi includono agitazione costante per prevenire l’anossia della radice¹³. I batteri possono essere visualizzati o quantificati dalle radici delle piante dopo il trasferimento dal mezzo di colonizzazione o dal mezzo di manutenzione. Questo sistema idroponico è molto flessibile, consentendo di modificare facilmente le condizioni sperimentali e le sollecitazioni applicate a seconda degli interessi dei ricercatori.

Questo metodo descritto è importante nel contesto della più ampia letteratura sulle interazioni pianta-microbo perché fornisce un sistema robusto per studiare queste interazioni sulla superficie della radice, pur essendo personalizzabile alle preferenze di crescita di batteri diversi. I laboratori di biologia vegetale spesso eseguono esperimenti di colonizzazione pianta-microbo su agar solido, consentendo solo il movimento planare (se questo) di batteri, richiedendo anche la manipolazione potenzialmente distruttiva delle piante durante il successivo trasferimento. Al contrario, i laboratori di microbiologia hanno spesso dato priorità alla salute dei batteri all’interno dei loro esperimenti, a scapito delle piante^14,15. Queste diverse priorità dei laboratori incentrati sulle piante e la microbiologia hanno storicamente reso storicamente difficile confrontare i risultati tra questi gruppi, poiché ognuno in genere ottimizza le condizioni sperimentali per ottimizzare il loro organismo di interesse¹⁵. Il sistema di crescita delle piante a maglie galleggianti descritto qui previene l’immersione totale delle piante, un notevole vantaggio per i precedenti studi orientati alla microbiologia, ottimizzando anche temporaneamente la crescita e la sopravvivenza dei batteri per facilitare la colonizzazione. Così, il test che presentiamo qui può affrontare le preoccupazioni sia dei biologi delle piante (circa l’eccessiva idratazione e la manipolazione tattile della pianta) soddisfacendo i criteri dei microbiologi (consentendo diverse condizioni di crescita batterica e molteplici interazioni delle specie)⁷. Questo protocollo è progettato per essere adattabile per l’uso con vari batteri, piante e condizioni ambientali.

Protocol

NOTA: la configurazione sperimentale viene descritta per chiarezza e utilizzata per generare i risultati rappresentativi inclusi in questo report, ma le condizioni possono essere modificate come desiderato. Tutte le misure devono essere eseguite utilizzando PPE e seguendo le ricattie istituzionali e federali per la sicurezza, secondo lo stato BSL dei batteri utilizzati. 1. Caratterizzazione dei batteri Determinare la morfologia dei batteri sulla piastra di agar medio di crescita. Ris…

Representative Results

Il ben caratterizzato PGPB P. simiae WCS417r è noto per colonizzare le radici di A. thaliana nella cultura idroponica. Questo batterio naturalmente fluorescente può essere facilmente visualizzato utilizzando la microscopia sulle radici delle piantine dopo la colonizzazione (Figura 2). Anche se è possibile immaginare l’intera lunghezza di queste radici di a. thaliana (lunghezza 4-6 mm), farlo per molte piante richiederebbe una qua…

Discussion

Le piante in tutti gli ambienti interagiscono con migliaia a milioni di diversi batteri e funghi^5,7. Queste interazioni possono avere un impatto negativo e positivo sulla salute delle piante, con potenziali effetti sulla resa delle colture e sulla produzione alimentare. Lavori recenti suggeriscono anche che la colonizzazione variabile delle colture da parte dei PGPB può spiegare le dimensioni imprevedibili delle piante e la resa delle colture nelle prove sul cam…

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017