Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System
Summary
Hier beschreiben wir einen hydroponischen Pflanzenwachstumstest zur Quantifizierung des Artenvorkommens und zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach deren Übertragung in verschiedene Wachstumsumgebungen.
Abstract
Bakterien bilden komplexe Rhizosphären-Mikrobiome, die durch interagierende Mikroben, größere Organismen und die abiotische Umgebung geformt werden. Unter Laborbedingungen kann die Besiedlung der Rhizosphäre durch pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen im Vergleich zu nicht kolonisierten Pflanzen erhöhen. In Feldumgebungen bieten bakterielle Behandlungen mit PGPB jedoch oft keine wesentlichen Vorteile für Die Kulturen. Eine Erklärung ist, dass dies auf den Verlust der PGPB während der Wechselwirkungen mit endogenen Bodenmikroben über die Lebensdauer der Pflanze zurückzuführen sein kann. Diese Möglichkeit war schwer zu bestätigen, da sich die meisten Studien auf die anfängliche Kolonisierung konzentrieren und nicht auf die Aufrechterhaltung von PGPB innerhalb von Rhizosphärengemeinschaften. Es wird hier vermutet, dass die Montage, Koexistenz und Aufrechterhaltung von Bakteriengemeinschaften durch deterministische Merkmale der Rhizosphäre Mikroumgebung geformt sind, und dass diese Wechselwirkungen das ÜBERLEBEN von PGPB in nativen Umgebungen beeinflussen können. Um diese Verhaltensweisen zu untersuchen, wird ein hydroponischer Pflanzenwachstumstest mit Arabidopsis thaliana optimiert, um die räumliche Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach der Übertragung auf verschiedene Wachstumsergebnisse zu quantifizieren und zu visualisieren. Umgebungen. Die Reproduzierbarkeit und nützlichkeit dieses Systems werden dann mit dem gut untersuchten PGPB Pseudomonas simiaevalidiert. Um zu untersuchen, wie das Vorhandensein mehrerer Bakterienarten die Besiedlungs- und Erhaltungsdynamik auf der Pflanzenwurzel beeinflussen kann, eine Modellgemeinschaft aus drei Bakterienstämmen (ein Arthrobacter, Curtobacteriumund Microbacterium Ursprünglich aus der A. thaliana Rhizosphäre isoliert, ist konstruiert. Es wird gezeigt, dass das Vorhandensein dieser verschiedenen Bakterienarten mit diesem hydroponischen Pflanzen-Maintanence-Assay gemessen werden kann, der eine Alternative zu Sequenzierungsbasierten bakteriellen Gemeinschaftsstudien bietet. Zukünftige Studien mit diesem System können das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in Mehrarten-Pflanzenmikrobiomen im Laufe der Zeit und in sich verändernden Umweltbedingungen verbessern.
Introduction
Die Zerstörung von Pflanzen durch bakterielle und Pilzkrankheiten führt zu einer geringeren Nahrungsmittelproduktion und kann die globale Stabilität stark stören1. Basierend auf der Entdeckung, dass Mikroben in unterdrückenden Böden für die Erhöhung der Pflanzengesundheit verantwortlich sind2, haben Wissenschaftler gefragt, ob das Pflanzenmikrobiom genutzt werden kann, um das Pflanzenwachstum zu unterstützen, indem das Vorhandensein und die Fülle bestimmter Bakterienarten3. Bakterien, die beim Pflanzenwachstum oder bei der Entwicklung helfen, werden kollektiv als pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) bezeichnet. In jüngerer Zeit haben sich Studien von der einfachen Identifizierung potenzieller PGPB zu dem Verständnis verschoben, wie Interkingdom-Wechselwirkungen im Boden, um Wurzeln oder in der Rhizosphäre (das Gebiet, das direkt um die Wurzeloberfläche liegt) DIE PGPB beeinflussen können. Aktivität4.
Rhizosphäre Kolonisation durch PGPB kann die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen als Reaktion auf verschiedene Stressoren im Vergleich zu unkolonisierten Pflanzenerhöhen 5. Allerdings sind die Ergebnisse bei einheimischen Bodenverhältnissen oft variabler als in den eng kontrollierten Gewächshäusern und Laborumgebungen6. Eine Hypothese für diesen Unterschied ist, dass das Wachstum oder Verhalten von PGPB durch einheimische Bodenbakterien oder Pilze in den Feldern7,8gehemmt werden kann. Günstige Effekte von RhizosphäreBakterien hängen in der Regel von der Fähigkeit der Bakterien ab, 1) zu lokalisieren und sich in Richtung der Wurzel zu bewegen, 2) die Wurzel durch Biofilmbildung zu besiedeln und 3) mit der Wirtspflanze oder Krankheitserregern über die Produktion kleiner Moleküle zu interagieren Metaboliten7,9. Jedes dieser Kolonisierungsverhalten kann durch das Vorhandensein und die Aktivität benachbarter Mikroben beeinflusst werden10.
Wir haben ein System entwickelt, um diese ausgeprägten bakteriellen Besiedlungsstadien der Rhizosphäre zu quantifizieren und zu visualisieren (Abbildung 1). Dieser Ansatz wird Studien erleichtern, die untersuchen, warum die langfristige PGPB-Wartung nach der Übertragung von Pflanzen in neue Umgebungen, wie z. B. bei der Anpflanzung von vorgeimpften Sämlingen, manchmal nicht beobachtet wird. Arabidopsis thaliana als Pflanzenmodell aufgrund seiner umfangreichen Verwendung in Laborstudien sowie der umfangreichen verfügbaren Daten über seine mikrobiellen Wechselwirkungen11. Es gibt drei Stufen im System: 1) A. thaliana Wachstum, 2) bakterielle Besiedlung und 3) bakterielle Erhaltung (siehe Abbildung 1). Da A. thaliana eine terrestrische Pflanze ist, war es wichtig sicherzustellen, dass sie nicht übermäßigen Wasserstress im hydroponischen System erlitt12. Inspiriert von den Methoden von Haney et al.13,werden die Sämlinge auf Kunststoffgitter numeriert, um den Trieb vom flüssigen Wachstumsmedium zu trennen. Dieses System scheint die Gesundheit und Entwicklung des Pflanzenwirts nicht zu beeinträchtigen, und es verbessert das A. thaliana Wachstum in flüssigen11. Während der Pflanzentrieb über der Oberfläche schwebt, werden die Wurzeln vollständig der Besiedlung durch Bakterien ausgesetzt, die in das flüssige bakterielle Wachstumsmedium eingeimpft werden. Dies ermöglicht es Bakterien von Interesse auf die Besiedlung in Nährstoffen untersucht werden, die am meisten förderlich für das Wachstum sind, während dann die Bedingungen verschieben, damit die Pflanze weiterhin in einem Nährstoffmedium wachsen, das entwickelt wurde, um sein Wachstum zu unterstützen. Beide Stadien beinhalten stetiges Schütteln, um Anoxie der Wurzel13zu verhindern. Bakterien können aus den Pflanzenwurzeln nach dem Transfer aus dem Besiedlungsmedium oder dem Pflegemedium visualisiert oder quantifiziert werden. Dieses hydroponische System ist sehr flexibel, so dass experimentelle Bedingungen und angewandte Spannungen je nach Interessen der Forscher leicht verändert werden können.
Diese beschriebene Methode ist im Kontext des größeren Literaturkörpers über Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen wichtig, da sie ein robustes System zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen an der Wurzeloberfläche bietet und gleichzeitig an die Wachstumspräferenzen von verschiedenen Bakterien. Pflanzenbiologie-Labore führen oft Pflanzen-Mikroben-Kolonisationsexperimente an festen Agarn durch, sodass nur eine planare Bewegung (wenn dies) von Bakterien möglich ist, während gleichzeitig die potenziell destruktive Manipulation von Pflanzen während der späteren Übertragung erforderlich ist. Im Gegensatz dazu haben mikrobiologische Labore häufig die Gesundheit der Bakterien in ihren Experimenten priorisiert, zum Nachteil der Pflanzen14,15. Diese unterschiedlichen Prioritäten pflanzen- und mikrobiologischer Labore haben es in der Vergangenheit schwierig gemacht, die Ergebnisse zwischen diesen Gruppen zu vergleichen, da jede in der Regel experimentelle Bedingungen optimiert, um ihren Organismus von Interesse zu optimieren15. Das hier beschriebene Floating-Mesh-Pflanzen-Wachstumssystem verhindert das vollständige Eintauchen von Pflanzen, ein bemerkenswerter Vorteil früherer mikrobiologisch-orientierter Studien, während gleichzeitig das Wachstum und Überleben von Bakterien vorübergehend optimiert wird, um die Kolonisation zu erleichtern. So kann der Test, den wir hier vorstellen, Bedenken sowohl von Pflanzenbiologen (über Überfeuchtung und taktile Manipulation der Pflanze) als auch die Erfüllung der Kriterien von Mikrobiologen (die unterschiedliche bakterielle Wachstumsbedingungen und mehrere Wechselwirkungen der Arten)7. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für den Einsatz mit verschiedenen Bakterien, Pflanzen und Umweltbedingungen anpassungsfähig ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pflanzen in allen Umgebungen interagieren mit Tausenden bis Millionen von verschiedenen Bakterien und Pilzen5,7. Diese Wechselwirkungen können sich entweder negativ und positiv auf die Pflanzengesundheit auswirken, mit möglichen Auswirkungen auf den Ernteertrag und die Nahrungsmittelproduktion. Jüngste Arbeiten deuten auch darauf hin, dass eine variable Besiedlung von Kulturen durch PGPBs für unvorhersehbare Pflanzengröße und Ernteerträge in Feldversuchen …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Forschungsmittel des Department of Energy Biological and Environmental Research (DOE-BER 0000217519 to E.A.S.), der National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S), unterstützt. SLH wurde auch vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unterstützt. Wir danken Dr. Jeffery Dangl für die Bereitstellung von Bakterienstämmen und unschätzbareEinblicke. Wir danken Dr. Andrew Klein und Matthew J. Powers für experimentelle Vorschläge. Schließlich möchte sLH sich bei den Verbindungen in den sozialen Medien dafür bedanken, dass sie uns daran erinnert haben, dass die Verbreitung von Wissenschaft ein Privileg und eine Verantwortung ist, insbesondere durch kreative und zugängliche Mittel.
Materials
| Required Materials | |||
| 1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
| 24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
| Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
| Autoclave | any | N/A | |
| Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
| BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
| bleach | any | N/A | |
| Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
| Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Flame | any | N/A | |
| Forceps | any | N/A | |
| Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
| Hydrochloric Acid | any | N/A | |
| Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
| Microcentrifuge | any | N/A | |
| Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
| Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
| MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
| Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
| Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
| Reservoirs | any | N/A | |
| Spectrophotometer | any | N/A | |
| Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
| Sterile water | any | N/A | |
| Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
| Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
| Ultrasonicator | any | N/A | |
| Vortex Mixer | any | N/A | |
| X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
| Suggested Materials | |||
| 24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
| Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
| Glass beads | any | N/A | |
| Multipetter/Repetter | any | N/A | |
| Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
| Biological Materials Used | |||
| Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
| Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
| Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
| Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |
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