Overvågning bakteriel kolonisering og vedligeholdelse på Arabidopsis thaliana rødder i en flydende hydroponiske system

Summary

Her beskriver vi en hydroponiske plantevækst assay til at kvantificere arter tilstedeværelse og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter deres overførsel i forskellige vækst miljøer.

Abstract

Bakterier danner komplekse rhizosfæren mikrobiomer formet ved at interagere mikrober, større organismer, og det abiotiske miljø. Under laboratorieforhold, rhizosfæren kolonisering af plantevækst fremmende bakterier (pgpb) kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter i forhold til uncolonized planter. Men i Feltindstillinger, bakterie behandlinger med PGPB ofte ikke giver betydelige fordele for afgrøder. En forklaring er, at dette kan skyldes tab af PGPB under interaktioner med endogene jord mikrober i løbet af anlæggets levetid. Denne mulighed har været vanskeligt at bekræfte, da de fleste undersøgelser fokuserer på den oprindelige kolonisering snarere end vedligeholdelse af pgpb inden rhizosfæren samfund. Det er en hypotese her, at forsamlingen, sameksistens, og vedligeholdelse af bakterie samfund er formet af deterministiske funktioner i rhizosfæren mikromiljø, og at disse interaktioner kan påvirke pgpb overlevelse i native indstillinger. For at studere disse adfærd, en hydroponiske plante-vækst assay er optimeret ved hjælp af Arabidopsis thaliana at kvantificere og visualisere den rumlige fordeling af bakterier under indledende kolonisering af planterødder og efter overførsel til forskellige vækst Miljøer. Dette Systems reproducerbarhed og anvendelighed valideres derefter med den studerede pgpb Pseudomonas simiae prosimiae. At undersøge, hvordan tilstedeværelsen af flere bakterielle arter kan påvirke kolonisering og vedligeholdelse dynamik på planten roden, en model samfund fra tre bakterielle stammer (en Arthrobacter, Curtobacterium, og microbacterium arter) oprindeligt isoleret fra a. thaliana rhizosfæren er konstrueret. Det er påvist, at tilstedeværelsen af disse forskellige bakteriearter kan måles ved hjælp af denne hydroponiske plante-maintanence assay, som giver et alternativ til Sequencing-baserede bakterielle fællesskabsundersøgelser. Fremtidige undersøgelser ved hjælp af dette system kan forbedre forståelsen af bakteriel adfærd i multi arter plante mikrobiomer over tid og i skiftende miljømæssige forhold.

Introduction

Afgrøde ødelæggelse af bakterielle og svampesygdomme resulterer i sænket fødevareproduktion og kan alvorligt forstyrre den globale stabilitet¹. Baseret på opdagelsen af, at mikrober i suppressiv jord er ansvarlige for at øge plantesundheden², har forskerne spurgt, om plante mikrobiomet kan udnyttes til at støtte plantevækst ved at ændre tilstedeværelsen og overflod af særlige bakteriearter³. Bakterier fundet at støtte i plantevækst eller udvikling er kollektivt betegnes plantevækst fremmende bakterier (PGPB). For nylig har undersøgelser skiftet fra blot at identificere potentielle PGPB til at forstå, hvordan interkingdom interaktioner i jorden, omkring rødder, eller i rhizosfæren (området direkte omgivende og herunder rodoverfladen) kan påvirke PGPB aktivitet⁴.

Rhizosphere kolonisering af PGPB kan øge sundheden eller udviklingen af værtsplanter som reaktion på forskellige stressorer i forhold til uncolonized planter⁵. Men, resultaterne er ofte mere variabel i indfødte jordforhold sammenlignet med dem, der er observeret i de nøje kontrollerede drivhus og laboratorie indstillinger⁶. En hypotese for denne forskel er, at vækst eller opførsel af pgpb kan hæmmes af indfødte jord bakterier eller svampe i markerne^7,8. Gavnlige virkninger af rhizosfæren bakterier generelt afhænge af bakteriernes evne til 1) lokalisere og bevæge sig mod roden, 2) kolonisere roden gennem biofilm dannelse, og 3) interagere med værts planten eller patogener via produktion af små molekyle metabolitter^7,9. Enhver af disse kolonisering adfærd kan blive påvirket af tilstedeværelsen og aktiviteten af tilstødende mikrober¹⁰.

Vi har designet et system til at kvantificere og visualisere disse særskilte bakterielle kolonisation stadier af rhizosfæren (figur 1). Denne fremgangsmåde vil gøre det lettere at undersøge, hvorfor langtids vedligeholdelse af PGPB undertiden ikke observeres efter overførsel af planter til nye miljøer, såsom ved plantning af præ-inokulerede planter. Arabidopsis thaliana som blev valgt som en plante model på grund af sin omfattende brug i laboratorieundersøgelser samt de rigelige data tilgængelige om dens mikrobielle interaktioner¹¹. Der er tre stadier i systemet: 1) A. thaliana vækst, 2) bakteriel kolonisering, og 3) bakteriel vedligeholdelse (Se figur 1). Fordi a. thaliana er et jordbaseret anlæg, var det vigtigt at sikre, at det ikke var udsat for unødig vand stress i det hydroponiske system¹². Inspireret af de metoder, der anvendes af Haney et al.¹³, dyrkes frøplanterne på plastik mesh for at adskille skuddet fra det flydende vækstmedium. Dette system synes ikke at kompromittere sundhed og udvikling af anlægget vært, og det forbedrer en. thaliana vækst i flydende¹¹. Som planten skyde flyder over overfladen, rødderne er fuldt udsat for kolonisering af bakterier inokuleret i den flydende bakterielle vækstmedium. Dette tillader bakterier af interesse at blive undersøgt for kolonisering i næringsstoffer, der er mest befordrende for vækst, mens derefter skiftende betingelser for at gøre det muligt for planten at fortsætte med at vokse i et næringsstof medium designet til at støtte sin vækst. Begge stadier omfatter konstant rystning for at forhindre anoxia af roden¹³. Bakterier kan visualiseres eller kvantificeres fra plantens rødder efter overførsel fra enten koloniserings mediet eller vedligeholdelses mediet. Dette hydroponiske system er meget fleksibelt, hvilket tillader eksperimentelle betingelser og anvendte belastninger, der let kan ændres afhængigt af forskernes interesser.

Denne beskrevne metode er vigtig i forbindelse med den større mængde litteratur om plante mikrobe interaktioner, fordi den giver et robust system til at studere disse interaktioner på rodoverfladen, samtidig med at de kan tilpasses til vækst præferencerne for forskellige bakterier. Plant biologi Labs ofte udføre plante-Microbe kolonisering eksperimenter på solid agar, giver mulighed for kun planar bevægelse (hvis det) af bakterier, samtidig med at der kræves en potentielt destruktiv manipulation af planter under efterfølgende overførsel. I modsætning hertil har mikrobiologiske laboratorier ofte prioriteret sundhed bakterier i deres eksperimenter, til skade for planterne^14,15. Disse forskellige prioriteringer af plante-og Mikrobiologi-fokuserede laboratorier har historisk gjort det vanskeligt at sammenligne resultater mellem disse grupper, da hver typisk optimerer eksperimentelle betingelser for at optimere deres organisme af interesse¹⁵. Den flydende-mesh-plante-vækst system, der er beskrevet her forhindrer fuld plante nedsænkning, en bemærkelsesværdig fordel til tidligere mikrobiologiske-orienterede undersøgelser, mens også midlertidigt at optimere vækst og overlevelse af bakterier til at lette kolonisering. Således kan den analyse, vi præsenterer her, behandle bekymringer fra både plante biologer (om over-hydrering og taktile manipulation af planten), mens opfylder kriterierne for mikrobiologer (giver mulighed for forskellige bakterielle vækstbetingelser og flere Arts interaktioner)⁷. Denne protokol er designet til at kunne tilpasses til brug med forskellige bakterier, planter og miljøforhold.

Protocol

Bemærk: den eksperimentelle opsætning er beskrevet for klarhed og bruges til at generere de repræsentative resultater, der er inkluderet i denne rapport, men betingelserne kan ændres som ønsket. Alle trin skal udføres ved hjælp af PV og efter institutionelle og føderale reccomendations for sikkerhed, i henhold til BSL status for de anvendte bakterier. 1. karakterisering af bakterier Bestem morfologien af bakterier på vækstmedium agar pladen. Gensuspender cellerne med en omt…

Representative Results

Den velkarakteriserede pgpb P. simiae prosimiae WCS417r er kendt for at kolonisere rødderne af A. thaliana i hydroponiske kultur. Denne naturligt fluorescerende bakterie kan nemt visualiseres ved hjælp af mikroskopi på rødderne af frøplanter efter kolonisering (figur 2). Selv om det er muligt at billede den fulde længde af disse A. thaliana frøplanter ‘ (4 – 6 mm længde) rødder, gør det for mange planter ville tage en pr…

Discussion

Planter i alle miljøer interagerer med tusinder til millioner af forskellige bakterier og svampe^5,7. Disse interaktioner kan enten have en negativ og positiv indvirkning på plantesundheden med potentielle virkninger på afgrødeudbyttet og fødevareproduktionen. Det seneste arbejde antyder også, at variabel kolonisering af afgrøder fra PGPBs kan være en uforudsigelig plante størrelse og afgrødeudbytte i feltforsøg²². Forståelse me…

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017