Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler
Summary
Odlade primära eller etablerade cellinjer används ofta för att ta itu med grundläggande biologiska och mekanistiska frågor som en initial metod innan du använder djur modeller. Detta protokoll beskriver hur man förbereder hela cell extrakt och subcellulära fraktioner för studier av zink (Zn) och andra spår ämnen med atomabsorptionsspektroskopi.
Abstract
Över gångs metaller är essentiella mikronäringsämnen för organismer men kan vara giftiga för celler vid höga koncentrationer genom att konkurrera med fysiologiska metaller i proteiner och generera Redox stress. Sjukdoms tillstånd som leder till metall utarmning eller ackumulering är kausala smittämnen av olika mänskliga sjukdomar. Några exempel är anemi, acrodermatitis enteropathica, och Wilsons och Menkes ‘ sjukdomar. Det är därför viktigt att kunna mäta nivåerna och transporten av över gångs metaller i biologiska prover med hög känslighet och noggrannhet för att under lätta forskning om hur dessa faktorer bidrar till normala fysiologiska funktioner och Toxicitet. Zink (Zn), till exempel, är en kofaktor i många däggdjurs proteiner, deltar i signalering händelser, och är en sekundär bud bärare i celler. I överskott, Zn är giftigt och kan hämma absorptionen av andra metaller, medan i underskott, det kan leda till en mängd potentiellt dödliga förhållanden.
Grafit ugnen atomabsorptionsspektroskopi (GF-AAS) ger en mycket känslig och effektiv metod för bestämning av Zn och andra över gångs metaller koncentrationer i olika biologiska prover. Elektrotermisk atomisering via GF-AAS kvantifierar metaller genom att Atomisera små mängder prover för efterföljande selektiv absorptionsanalys med hjälp av våglängd av excitation av elementet av intresse. Inom gränserna för den linearitet av Beer-Lambert lag, är absorbansen av ljus av metallen direkt proportionell mot koncentrationen av analyten. Jämfört med andra metoder för bestämning av Zn-halt detekterar GF-AAS både fri och komplex Zn i proteiner och möjligen i små intracellulära molekyler med hög känslighet i små prov volymer. Dessutom är GF-AAS också mer lättillgängligt än induktivt kopplad plasmasspektrometri (ICP-MS) eller synkrotronbaserad röntgenfluorescens. I denna metod beskrivs den systematiska prov beredningen av olika odlade cellinjer för analyser i en GF-AAS. Variationer i detta spår element jämfördes i både hela celllysat och subcellulära fraktioner av prolifererande och differentierade celler som bevis på principen.
Introduction
Över gången och tung metaller, såsom Zn, Cu, mn, och FE, finns naturligt i miljön i både näringsämnen i livsmedel och föroreningar. Alla levande organismer kräver olika mängder av dessa mikronäringsämnen; exponering för höga halter är emellertid skadlig för organismer. Metall förvärv är främst genom kosten, men metaller kan också inhaleras eller absorberas genom huden1,2,3,4,5. Det är viktigt att notera att närvaron av metaller i atmosfäriska partiklar ökar och har till stor del för knippas med hälso risker. På grund av antropogena aktiviteter har ökade nivåer av tung metaller såsom AG, as, CD, CR, Hg, ni, Fe och PB upptäckts i atmosfäriska partiklar, regn vatten och jord6,7. Dessa metaller har potential att konkurrera med essentiella fysiologiska spår ämnen, särskilt Zn och FE, och de inducerar toxiska effekter genom att inaktivera grundläggande enzymer för biologiska processer.
Spår elementet Zn är redoxneutral och fungerar som en Lewis-syra i biologiska reaktioner, vilket gör den till en grundläggande kofaktor som är nödvändig för protein vikning och katalytisk aktivitet i över 10% av däggdjurs proteiner8,9, och 10; Därför är det viktigt för olika fysiologiska funktioner8,11. Men liksom många spår ämnen, det finns en känslig balans mellan dessa metaller som underlättar normal fysiologisk funktion och orsakar toxicitet. Hos däggdjur, Zn brister leda till anemi, tillväxthämning, hypogonadism, hud avvikelser, diarré, alopeci, smak rubbningar, kronisk inflammation, och nedsatt immun försvar och neurologiska funktioner11,12, 13,14,15,16,17,18. I överskott är Zn cytotoxiskt och försämrar absorptionen av andra essentiella metaller som koppar19,20,21.
Dessutom, vissa metaller som Cu och FE har potential att delta i skadliga reaktioner. Produktion av reaktiva syreradikaler (ros) via Fenton kemi kan störa monteringen av järn svavel kluster proteiner och ändra lipidmetabolismen22,23,24. För att förhindra denna skada, celler utnyttja metall-bindande Chaperones och transportörer för att förhindra toxiska effekter. Utan tvekan, metall homeostas måste vara hårt kontrollerad för att säkerställa att specifika cell typer upprätthålla korrekt nivåer av metaller. Av denna anledning finns det ett betydande behov av att avancera tekniker för noggrann mätning av spår metaller i biologiska prover. Vid utveckling och mogna organismer finns det ett Differentiellt biologiskt behov av spår ämnen på cell nivå, vid olika utvecklingsstadier, och under normala och patologiska förhållanden. Därför är exakt bestämning av vävnad och systemisk metall nivåer krävs för att förstå organismers metall homeostas.
Grafit ugnen atomabsorptionsspektrometri (GF-AAS) är en mycket känslig teknik som används för små prov volymer, vilket gör den idealisk för att mäta över gången och tung metaller som finns i biologiska och miljömässiga prover25,26 , den 27 , 28. på grund av den höga känsligheten hos tekniken har det visat sig lämpligt att studera de fina transport egenskaperna hos na+/K+-ATPas och gastric H+/K+-ATPas med Xenopus oocyter som modell system29. I GF-AAS absorberar de atomiserade elementen i ett prov en våglängd av strålning som avges av en ljus källa som innehåller metall av intresse, med den absorberade strålningen proportionell mot koncentrationen av elementet. Elementär elektronisk excitation sker vid absorption av ultraviolett eller synlig strålning i en kvantiserad process som är unik för varje kemiskt grundämne. I en enda elektron process innebär absorptionen av en fotonen en elektron som rör sig från en lägre energi nivå till högre nivå inom Atomen och GF-AAS bestämmer mängden fotoner som absorberas av provet, vilket står i proportion till antalet strålabsorberande element som är atomiserade i grafit röret.
Selektiviteten i denna teknik bygger på den elektroniska strukturen av atomerna, där varje element har en specifik absorption/emission spektrallinje. När det gäller Zn är absorbansvåglängderna 213,9 nm och kan skilja sig exakt från andra metaller. Sammantaget kan GF-AAS användas för att kvantifiera Zn med adekvata detektions gränser (LOD) och hög känslighet och selektivitet25. Förändringarna i absorberad våglängd är integrerade och presenteras som toppar av energiabsorption vid specifika och isolerade våg längder. Koncentrationen av Zn i ett givet prov beräknas vanligen utifrån en standard kurva över kända koncentrationer enligt Beer-Lambert-lagen, i vilken absorbansen är direkt proportionell mot koncentrationen av Zn i provet. Men att tillämpa Beer-Lambert ekvationen till GF-AAS analyser uppvisar också vissa komplikationer. Till exempel kan variationer i atomisering och/eller icke-homogena koncentrationer av proverna påverka metall mätningar.
Den metall atomisering som krävs för GF AAS spår elementär analys består av tre grundläggande steg. Det första steget är desolvation, där vätskan lösnings medlet är avdunsta; lämnar torra föreningar efter ugnen når en temperatur på cirka 100 ° c. Sedan, föreningarna förångas genom att värma dem från 800 till 1 400 ° c (beroende på elementet som skall analyseras) och bli en gas. Slutligen, föreningarna i det gasformiga tillståndet är atomiserade med temperaturer som sträcker sig från 1 500 till 2 500 ° c. Som diskuterats ovan, ökande koncentrationer av en metall av intresse kommer att göra proportionella ökningar på absorptionen upptäcks av GF-AAS, men ugnen minskar det dynamiska omfånget av analys, vilket är den arbets område av koncentrationer som kan bestäms av instrumentet. Således kräver tekniken låga koncentrationer och en noggrann bestämning av det dynamiska omfånget av metoden genom att bestämma LOD och gräns för linearitet (LOL) av Beer-Lambert lag. LOD är den minsta mängd som krävs för att ett ämne ska kunna detekteras, definierat som tre gånger standard avvikelsen för Zn i matrisen. Den LOL är den maximala koncentrationen som kan detekteras med hjälp av Beer-Lambert lag.
I detta arbete beskriver vi en standard metod för att analysera halterna av Zn i hela cell extrakt, cytoplasmatiska och nukleära fraktioner, och i att proliferera och differentiera odlade celler (figur 1). Vi anpassade den snabba isoleringen av nuklei-protokoll till olika cellulära system för att förhindra metall förlust under prov beredning. De cellulära modeller som används var primära myoblaster härrör från mus satellit celler, murina neuroblastom celler (N2A eller Neuro2A), murina 3T3 L1 adipocyter, en mänsklig icke-tumorigenic bröst epitelial cellinjen (MCF10A), och epitelial madin-Darby hundnjure ( MDCK)-cellerna. Dessa celler bildades från olika linjer och är bra modeller för att undersöka härstamning specifika variationer av metall nivåer in vitro.
Primära myoblaster som härrör från mus satellit celler utgör en väl lämpad in vitro -modell för att undersöka skelett muskel differentiering. Proliferation av dessa celler är snabb när odlade under höga serum förhållanden. Differentiering i den muskulösa härstamning framkallas därefter av låga serum villkorar30. Den murina neuroblastom (N2A) etablerade cellinjen härstammar från mus neurala Crest. Dessa celler presenterar neuronala och amöbiska stamcells morfologi. Vid differentiering stimulans, den N2A celler presentera flera egenskaper av nerv celler, såsom neurofilament. N2A celler används för att undersöka Alzheimers sjukdom, neurit utväxt, och neurotoxicitet31,32,33. Den 3T3-L1 murina pre-adipocyter etablerade cellinjen används ofta för att undersöka de metabola och fysiologiska förändringar i samband med adipogenesis. Dessa celler presentera en fibroblast-liknande morfologi, men en gång stimuleras för differentiering, de presenterar enzymatisk aktivering i samband med lipid syntes och triglycerider ackumulering. Detta kan observeras som morfologiska förändringar för att producera cytoplasmatiska lipiddroppar34,35. MCF10A är en icke-tumör bröst epitelial cellinjen härrör från en premenopausala kvinna med bröst Fibrocystisk sjukdom36. Det har använts flitigt för biokemiska, molekyl ära och cellulära studier relaterade till bröstcancercarcinogenes såsom proliferation, cell migration, och invasion. Den Madin-Darby hundnjure (MDCK) epitelial cellinjen har i stor utsträckning använts för att undersöka egenskaper och molekyl ära händelser i samband med inrättandet av epitelial fenotyp. När de når sammanflödet, blir dessa celler polariserade och etablera cell-cell sammanväxningar, egenskaper hos däggdjurs epitelial vävnader37.
För att testa förmågan hos AAS att mäta nivåerna av Zn i däggdjurs celler, analyserade vi hela och subcellulära fraktioner (Cytosol och kärna) av dessa fem cellinjer. AAS mätningar visade olika koncentrationer av Zn i dessa cell typer. Koncentrationerna var lägre i prolifererande och differentierande primära myoblaster (4 till 7 nmol/mg protein) och högre i de fyra etablerade cellinjerna (allt från 20 till 40 nmol/mg protein). En liten icke-signifikant ökning av Zn-nivåer upptäcktes för att differentiera primära myoblaster och neuroblastom celler jämfört med prolifererande celler. Motsatt effekt upptäcktes i differentierade adipocyter. Men, prolifererande 3T3-L1 celler uppvisade högre koncentrationer av metallen jämfört med differentierade celler. Viktigt, i dessa tre cellinjer, subcellulär fraktionering visade att Zn är differentially distribueras i cytosolen och kärnan enligt metaboliska tillstånd av dessa celler. Till exempel, i prolifererande myoblaster, N2A celler, och 3T3-L1 pre-adipocyter, en majoritet av metallen är lokaliserad till kärnan. Vid induktion av differentiering med hjälp av specifika cell behandlingar, Zn lokaliserad till cytosolen i dessa tre cell typer. Intressant, båda epitelial cellinjer visade högre nivåer av Zn under proliferation jämfört med när når sammanflödet, där en karakteristisk tight enskiktslager bildades. I prolifererande epitelceller, bröst cellen linje MCF10A hade en lika Zn fördelning mellan Cytosol och kärna, medan i njurederiverade cellinjen, de flesta av metallen var placerad i kärnan. I dessa två cell typer, när cellerna nådde sammanflödet, var Zn huvudsakligen placerad till cytosolen. Dessa resultat visar att GF-AAS är en mycket känslig och noggrann teknik för att utföra elementär analys i lågavkastande prover. GF-AAS i kombination med subcellulär fraktionering och kan anpassas för att undersöka nivåerna av spår metall element i olika cellinjer och vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atomabsorptionsspektroskopi är en mycket känslig metod för bestämning av Zn i små volym/Mass biologiska prover. Den beskrivna optimeringen av Zn-mätningen gör tillämpningen av denna metod enkel och garanterar idealiska analytiska förhållanden. Här, med hjälp av GF-AAS, bestämde vi koncentrationen av Zn i hela celler, och i cytosoliskt och nukleära fraktioner, från olika cellinjer. Resultaten visar att denna teknik gör jämförbar med den som erhålls genom fluorescerande sonder och ICP-MS. Till exempel vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av fakulteten Diversity Scholars Award från University of Massachusetts Medical School till T.P.-B. N.N.-T. stöds av SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N stöds av National Science Foundation Grant DBI 0959476. Författarna är tacksamma för Dr Daryl A. Bosco för att tillhandahålla N2A cellinjen och Daniella Cangussu för hennes tekniska support.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
References
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
- Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
- Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
- Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
- McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
- Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
- Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
- Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
- Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
- Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
- Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
- Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
- Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
- Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
- Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
- Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
- Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
- Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
- Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
- Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
- Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
- Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
- Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
- Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
- Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Recherche en cancérologie. 50 (18), 6075-6086 (1990).
- Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
- Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
- Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
- Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
- Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
- Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
- Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
- Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
- Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
- Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
- Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
- Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).
