Atomaire absorptiespectroscopie om intracellulaire zink zwembaden in zoogdiercellen te meten
Summary
Gekweekte primaire of gevestigde cel lijnen worden vaak gebruikt om fundamentele biologische en mechanistische vragen als een eerste aanpak aan te pakken voor het gebruik van dierlijke modellen. Dit protocol beschrijft hoe u hele cel extracten en subcellulaire fracties voor de studies van zink (Zn) en andere sporenelementen met atomaire absorptiespectroscopie voor te bereiden.
Abstract
Overgang metalen zijn essentiële micronutriënten voor organismen, maar kan giftig zijn voor cellen bij hoge concentraties door te concurreren met fysiologische metalen in eiwitten en het genereren van redox stress. Pathologische omstandigheden die leiden tot uitputting van metaal of accumulatie zijn oorzakelijke agentia van verschillende ziekten van de mens. Enkele voorbeelden zijn anemie, acrodermatitis enteropathica, en Wilson en Menkes ‘ ziekten. Het is daarom belangrijk om de niveaus en het vervoer van overgangsmetalen in biologische monsters met een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te kunnen meten om onderzoek te vergemakkelijken om te onderzoeken hoe deze elementen bijdragen tot normale fysiologische functies en Toxiciteit. Zink (Zn), bijvoorbeeld, is een cofactor in veel zoogdieren eiwitten, participeert in signalering gebeurtenissen, en is een secundaire boodschapper in cellen. In overmaat, is Zn giftig en kan absorptie van andere metalen remmen, terwijl in tekort, het tot een verscheidenheid van potentieel dodelijke voorwaarden kan leiden.
Graphite Furnace atomaire absorptiespectroscopie (GF-AAS) biedt een zeer gevoelige en effectieve methode voor het bepalen van Zn en andere overgang metaal concentraties in diverse biologische monsters. Elektrothermische verneveling via GF-AAS kwantificeert metalen door atomiseren kleine hoeveelheden monsters voor de daaropvolgende selectieve absorptie analyse met behulp van golflengte van excitatie van het element van belang. Binnen de grenzen van de lineariteit van de bier-Lambert wet, de absorptie van licht door het metaal is direct evenredig aan de concentratie van de analyt. Vergeleken met andere methoden om Zn content te bepalen, detecteert GF-AAS zowel vrije als gecomplexeerde Zn in eiwitten en mogelijk in kleine intracellulaire moleculen met een hoge gevoeligheid in kleine sample volumes. Bovendien, GF-AAS is ook gemakkelijker toegankelijk dan inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie (ICP-MS) of synchotron-based X-Ray fluorescentie. Bij deze methode wordt de systematische monstervoorbereiding van verschillende gekweekte cel lijnen voor analyses in een GF-AAS beschreven. Variaties in dit spoorelement werden vergeleken in zowel hele cel lysaten en subcellulaire fracties van proliferatie en gedifferentieerde cellen als bewijs van principe.
Introduction
Overgang en zware metalen, zoals Zn, Cu, MN, en Fe, zijn van nature in het milieu gevonden in zowel voedingsstoffen in voedsel en verontreinigende stoffen. Alle levende organismen vereisen verschillende hoeveelheden van deze micronutriënten; echter, blootstelling aan hoge niveaus is schadelijk voor organismen. Metal acquisitie is voornamelijk door het dieet, maar metalen kunnen ook worden ingeademd of geabsorbeerd door de huid1,2,3,4,5. Het is belangrijk op te merken dat de aanwezigheid van metalen in atmosferische deeltjes neemt toe en is grotendeels geassocieerd met gezondheidsrisico’s. Wegens antropogene activiteiten, zijn de verhoogde niveaus van zware metalen zoals AG, zoals, cd, CR, Hg, ni, Fe, en PB ontdekt in atmosferische deeltjes kwestie, regenwater, en grond6,7. Deze metalen hebben het potentieel om te concurreren met essentiële fysiologische sporenelementen, met name Zn en Fe, en ze veroorzaken toxische effecten door het inactiveren van fundamentele enzymen voor biologische processen.
Het spoorelement Zn is redox neutraal en gedraagt zich als een Lewis zuur in biologische reacties, waardoor het een fundamentele cofactor die nodig is voor eiwit vouwen en katalytische activiteit in meer dan 10% van zoogdieren eiwitten8,9, 10; Bijgevolg is het essentieel voor diverse fysiologische functies8,11. Echter, net als vele sporenelementen, is er een delicaat evenwicht tussen deze metalen vergemakkelijken van de normale fysiologische functie en het veroorzaken van toxiciteit. Bij zoogdieren, Zn tekortkomingen leiden tot anemie, groeivertraging, hypogonadisme, huidafwijkingen, diarree, alopecia, smaakstoornissen, chronische ontsteking, en verminderde immuun-en neurologische functies11,12, 13,14,15,16,17,18. In overmaat, Zn is chemo en schaadt de absorptie van andere essentiële metalen zoals koper19,20,21.
Bovendien, sommige metalen zoals Cu en FE hebben het potentieel om deel te nemen aan schadelijke reacties. Productie van reactieve zuurstof soorten (Ros) via Fenton chemie kan interfereren met de assemblage van ijzerzwavel cluster eiwitten en Alter lipide metabolisme22,23,24. Om deze schade te voorkomen gebruiken cellen metaal-bindende chaperones en transporteurs om toxische effecten te voorkomen. Ongetwijfeld, metaal homeostase moet strak worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat specifieke soorten cellen te handhaven goede niveaus van metalen. Om deze reden, is er een significante behoefte om technieken voor nauwkeurige meting van spoormetalen in biologische steekproeven vooruit te gaan. Bij het ontwikkelen en rijpen van organismen bestaat er een differentiële biologische behoefte aan sporenelementen op cellulair niveau, in verschillende ontwikkelingsstadia, en in normale en pathologische omstandigheden. Daarom, nauwkeurige bepaling van weefsel en systemische metaal niveaus is noodzakelijk om organisch metaal homeostase te begrijpen.
Graphite Furnace atomaire absorptiespectrometrie (GF-aas) is een zeer gevoelige techniek die wordt gebruikt voor kleine monster volumes, waardoor het ideaal is om de overgang en zware metalen aanwezig zijn in biologische en milieu-monsters te meten25,26 , 27 , 28. Bovendien is het vanwege de hoge gevoeligheid van de techniek aangetoond dat het geschikt is voor het bestuderen van de fijne transport eigenschappen van na+/K+-ATPase en maag H+/K+-ATPase met behulp van Xenopus oöcyten als modelsysteem29. In GF-AAS, absorberen de verstoven elementen binnen een steekproef een golflengte van straling die door een lichtbron wordt uitgezonden die het metaal van belang bevat, met de geabsorbeerde straling evenredig aan de concentratie van het element. Elementaire elektronische excitatie vindt plaats bij absorptie van ultraviolette of zichtbare straling in een gequanteerd proces uniek voor elk chemisch element. In een enkel elektron proces, de absorptie van een foton gaat om een elektron verplaatsen van een lager energieniveau naar een hoger niveau binnen het Atoom en GF-AAS bepaalt de hoeveelheid fotonen geabsorbeerd door het monster, dat evenredig is aan het aantal straling absorberen elementen verstoven in de grafiet buis.
De selectiviteit van deze techniek berust op de elektronische structuur van de atomen, waarin elk element een specifieke absorptie/emissie spectrale lijn heeft. In het geval van Zn, de absorptie golflengte is 213,9 nm en kan precies worden onderscheiden van andere metalen. Globaal, kan GF-AAS worden gebruikt om Zn met adequate grenzen van opsporing (LOD) en hoge gevoeligheid en selectiviteit25te kwantificeren. De veranderingen in de geabsorbeerde golflengte zijn geïntegreerd en gepresenteerd als pieken van energie-absorptie op specifieke en geïsoleerde golflengten. De concentratie van de Zn in een bepaald monster wordt meestal berekend op basis van een standaardkromme van bekende concentraties volgens de wet bier-Lambert, waarbij de absorptie direct evenredig is met de concentratie van Zn in het monster. Echter, de toepassing van de beer-Lambert vergelijking met GF-AAS analyses presenteert ook een aantal complicaties. Bijvoorbeeld, variaties in de verneveling en/of niet-homogene concentraties van de monsters kan invloed hebben op de metalen metingen.
De metalen verneveling vereist voor GF AAS Trace Elemental Analysis bestaat uit drie fundamentele stappen. De eerste stap is desolvatie, waar het vloeibare oplosmiddel wordt verdampt; het verlaten van droge verbindingen na de oven bereikt een temperatuur van rond 100 °C. Vervolgens worden de verbindingen verdampt door ze te verwarmen van 800 tot 1.400 °C (afhankelijk van het te analyseren element) en een gas te worden. Tot slot, de verbindingen in de gasvormige staat zijn verstoven met temperaturen die variëren van 1.500 tot 2.500 ° c. Zoals hierboven besproken, zal het verhogen van de concentraties van een metaal van belang evenredige stijgingen van de absorptie gedetecteerd door de GF-AAS, maar de oven vermindert het dynamisch bereik van de analyse, dat is het werkbereik van concentraties die kunnen worden bepaald door het instrument. Zo, de techniek vereist lage concentraties en een zorgvuldige bepaling van het dynamisch bereik van de methode door het bepalen van de LOD en de grens van lineariteit (LOL) van de beer-Lambert wet. De LOD is de minimumhoeveelheid die nodig is om een stof te kunnen detecteren, gedefinieerd als drie maal de standaarddeviatie van Zn in de matrix. De LOL is de maximale concentratie die kan worden gedetecteerd met behulp van bier-Lambert wet.
In dit werk beschrijven we een standaardmethode om de niveaus van Zn te analyseren in hele cel extracten, cytoplasma en nucleaire fracties, en in het verspreiden en differentiëren van gekweekte cellen (Figuur 1). We hebben de snelle isolatie van kernen protocol aangepast aan verschillende cellulaire systemen om metaal verlies te voorkomen tijdens het monster voorbereiding. De gebruikte cellulaire modellen waren primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen, muizen neuroblastoma cellen (N2A of Neuro2A), muizen 3T3 L1 adipocyten, een menselijke niet-tumorigenic borst epitheel cel lijn (MCF10A), en epitheel Madin-Darby de Honds nier ( MDCK) cellen. Deze cellen werden gevestigd van verschillende lineages en zijn goede modellen voor het onderzoeken van Lineage specifieke variaties van metaal niveaus in vitro.
Primaire myoblasten afgeleid van muis satellietcellen vormen een goed geschikt in vitro model om skeletspier differentiatie te onderzoeken. De proliferatie van deze cellen is snel wanneer gekweekt onder hoge serum voorwaarden. Differentiatie in de gespierde afstamming wordt vervolgens geïnduceerd door lage serum condities30. De muizen neuroblastoma (N2A) gevestigde cel lijn werd afgeleid van de muis neurale kuif. Deze cellen aanwezig neuronale en amoeboid stamcel morfologie. Bij differentiatie stimulus, de N2A cellen presenteren verschillende eigenschappen van neuronen, zoals neurofilaments. N2a cellen worden gebruikt om de ziekte van Alzheimer te onderzoeken, neuriet uitgroei, en neurotoxiciteit31,32,33. De 3T3-L1 muizen pre-adipocyten gevestigde cel lijn wordt vaak gebruikt om de metabole en fysiologische veranderingen in verband met adipogenesis te onderzoeken. Deze cellen presenteren een fibroblast-achtige morfologie, maar eenmaal gestimuleerd voor differentiatie, ze presenteren enzymatische activering geassocieerd met lipide synthese en triglyceriden accumulatie. Dit kan worden waargenomen als morfologische veranderingen te produceren cytoplasma lipide druppeltjes34,35. MCF10A is een niet-tumor borstklier epitheel cel lijn afgeleid van een premenopauzale vrouw met borstkanker fibrocystische ziekte36. Het is op grote schaal gebruikt voor biochemische, moleculaire, en cellulaire studies met betrekking tot borst carcinogenese zoals proliferatie, cel migratie, en invasie. De Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheel cel lijn is uitvoerig gebruikt om de eigenschappen en moleculaire gebeurtenissen in verband met de oprichting van de epitheel fenotype te onderzoeken. Bij het bereiken van samenvloeiing, deze cellen worden gepolariseerd en vast te stellen cel-cel adhesies, kenmerken van zoogdier epitheelweefsels37.
Om het vermogen van AAS te testen om de niveaus van Zn in zoogdiercellen te meten, analyseerden we hele en subcellulaire fracties (cytosol en Nucleus) van deze vijf cel lijnen. AAS metingen toonden verschillende concentraties van Zn in deze cel types. De concentraties waren lager in het vermenigvuldigen en het onderscheiden van primaire myoblasten (4 tot 7 nmol/mg van proteïne) en hoger in de vier gevestigde cel lijnen (die zich van 20 tot 40 nmol/mg van proteïne uitstrekken). Een kleine niet-significante stijging van Zn niveaus werd ontdekt in het onderscheiden van primaire myoblasten en neuroblastoma cellen in vergelijking met het vermenigvuldigen van cellen. Het tegenovergestelde effect werd ontdekt in onderscheiden adipocyten. Nochtans, vertoonden de vermenigvuldigende 3T3-L1 cellen hogere concentraties van het metaal in vergelijking met onderscheiden cellen. Belangrijk, in deze drie cel lijnen, subcellulaire fractionering toonde aan dat Zn is gedifferentieerd verdeeld in de cytosol en de kern volgens de metabole toestand van deze cellen. Bijvoorbeeld, in het verspreiden zich myoblasten, N2A cellen, en 3T3-L1 pre-adipocyten, is een meerderheid van het metaal gelokaliseerd aan de kern. Bij de inductie van differentiatie met behulp van specifieke cel behandelingen, Zn gelokaliseerd om de cytosol in deze drie soorten cellen. Interessant is dat beide epitheelcellen hogere niveaus van Zn toonden tijdens de proliferatie in vergelijking met bij het bereiken van samenvloeiing, waarin een karakteristieke strakke monolayer werd gevormd. In de proliferatie van Epitheelcellen, de borstklieren cel lijn MCF10A had een gelijke Zn verdeling tussen de cytosol en de kern, terwijl in de nier-afgeleide cel lijn, het grootste deel van het metaal was gelegen in de kern. In deze twee cellen, toen de cellen samenvloeiing bereikten, was Zn voornamelijk gelegen aan de cytosol. Deze resultaten tonen aan dat GF-AAS is een zeer gevoelige en accurate techniek voor het uitvoeren van elementaire analyse in lage opbrengst monsters. GF-AAS in combinatie met subcellulaire fractionering en kan worden aangepast aan de niveaus van sporenmetalen elementen in verschillende cellen en weefsels te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atomaire absorptiespectroscopie is een zeer gevoelige methode voor Zn kwantificering in kleine volume/massa biologische monsters. De beschreven optimalisatie van Zn meting maakt toepassing van deze methode eenvoudig en garandeert ideale analytische condities. Hier, met behulp van GF-AAS, hebben we bepaald de concentratie van Zn in hele cellen, en in cytosolische en nucleaire fracties, uit verschillende cellen lijnen. De resultaten tonen aan dat deze techniek vergelijkbaar is met die verkregen door tl-sondes en ICP-MS. Bi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Faculty Diversity Scholars Award van de Universiteit van Massachusetts Medical School aan T.P.-B. N.N.-T. wordt ondersteund door SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N wordt ondersteund door de National Science Foundation Grant DBI 0959476. De auteurs zijn dankbaar Dr Daryl A. Bosco voor het verstrekken van de N2A Cell line en aan Daniella Cangussu voor haar technische ondersteuning.
Materials
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma Aldrich | I5879 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 1005706 | |
| Anti Brg1-antibody (G7) | Santa Cruz biotechnologies | sc-17796 | |
| Anti b-tubulin-antibody (BT7R) | Thermo Scientific | MA5-16308 | |
| Bradford | Biorad | 5000205 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) | ThermoFischer-Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12) | ThermoFischer-Gibco | 11320033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFischer-Gibco | 14190144 | |
| Epidemal Growth Factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFischer-Gibco | 16000044 | |
| Fibroblastic Growth Factor-Basic (FGF) (AA 10-155) | ThermoFischer-Gibco | PHG0024 | |
| Horse serum | ThermoFischer-Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Hydrogen Peroxide (H2O2) | Sigma Aldrich | 95321 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 91077C | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-A | ThermoFischer | 51300044 | |
| Nitric Acid (HNO3) | Sigma Aldrich | 438073 | |
| Nonidet P-40 (NP-40) | Thermo Scientific | 85125 | |
| OptiMEM (Reduced Serum Media) | ThermoFischer-Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFischer-Gibco | 15140148 | |
| PureCol (Collagen) | Advanced BioMatrix | 5005 | |
| Retionic Acid | Sigma Aldrich | PHR1187 | |
| Troglitazone | Sigma Aldrich | 648469-M | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFischer-Gibco | 25200056 | |
| Zinc (Zn) Pure Single-Element Standard, 1,000 µg/mL, 2% HNO3 | Perkin Elmer | N9300168 | |
| Established Cell Lines | |||
| 3T3-L1 | American Type Culture Collection | CL-173 | |
| MCDK | American Type Culture Collection | CCL-34 | |
| MCF10A | American Type Culture Collection | CRL-10317 | |
| N2A | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
| Equipment | |||
| Atomic Absortion spectrophotometer | PerkinElmer | Aanalyst 800 | |
| Bioruptor | Diagnode | UCD-200 |
References
- Sharma, B., Singh, S., Siddiqi, N. J. Biomedical implications of heavy metals induced imbalances in redox systems. Biomed Research International. 640754, (2014).
- Jaishankar, M., Tseten, T., Anbalagan, N., Mathew, B. B., Beeregowda, K. N. Toxicity, mechanism and health effects of some heavy metals. Interdisciplinary Toxicology. 7 (2), 60-72 (2014).
- Jan, A. T., et al. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants. International Journal of Molecular Science. 16 (12), 29592-29630 (2015).
- Manutsewee, N., Aeungmaitrepirom, W., Varanusupakul, P., Imyim, A. Determination of Cd, Cu, and Zn in fish and mussel by AAS after ultrasound-assisted acid leaching extraction. Food Chemistry. 101 (2), 817-824 (2007).
- Pereira, C. C., de Souza, A. O., Oreste, E. Q., Vieira, M. A., Ribeiro, A. S. Evaluation of the use of a reflux system for sample preparation of processed fruit juices and subsequent determination of Cr, Cu, K, Mg, Na, Pb, and Zn by atomic spectrometry techniques. Food Chemistry. 240, 959-964 (2018).
- McComb, J. Q., Rogers, C., Han, F. X., Tchounwou, P. B. Rapid screening of heavy metals and trace elements in environmental samples using portable X-ray fluorescence spectrometer, A comparative study. Water, Air, & Soil Pollution. 225 (12), (2014).
- Borgatta, J. P., Paskavitz, A., Kim, D., Navea, J. G. Comparative evaluation of iron leach from different sources of fly ash under atmospherically relevant conditions. Environmental Chemistry. 13, 902-912 (2016).
- Dufner-Beattie, J., Langmade, S. J., Wang, F., Eide, D., Andrews, G. K. Structure, function, and regulation of a subfamily of mouse zinc transporter genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (50), 50142-50150 (2003).
- Sekler, I., Sensi, S. L., Hershfinkel, M., Silverman, W. F. Mechanism and regulation of cellular zinc transport. Molecular Medicine. 13 (7-8), 337-343 (2007).
- Berg, J. M., Shi, Y. The galvanization of biology: a growing appreciation for the roles of zinc. Science. 271 (5252), 1081-1085 (1996).
- Kambe, T., Tsuji, T., Hashimoto, A., Itsumura, N. The Physiological, Biochemical, and Molecular Roles of Zinc Transporters in Zinc Homeostasis and Metabolism. Physiology Reviews. 95 (3), 749-784 (2015).
- Fukada, T., Kambe, T. Molecular and genetic features of zinc transporters in physiology and pathogenesis. Metallomics. 3 (7), 662-674 (2011).
- Prasad, A. S., Halsted, J. A., Nadimi, M. Syndrome of iron deficiency anemia, hepatosplenomegaly, hypogonadism, dwarfism and geophagia. American Journal of Medicine. 31, 532-546 (1961).
- Jinno, N., Nagata, M., Takahashi, T. Marginal zinc deficiency negatively affects recovery from muscle injury in mice. Biological Trace Element Research. 158 (1), 65-72 (2014).
- Gaither, L. A., Eide, D. J. Eukaryotic zinc transporters and their regulation. Biometals. 14 (3-4), 251-270 (2001).
- Fukada, T., Yamasaki, S., Nishida, K., Murakami, M., Hirano, T. Zinc homeostasis and signaling in health and diseases: Zinc signaling. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 16 (7), 1123-1134 (2011).
- Kambe, T., Hashimoto, A., Fujimoto, S. Current understanding of ZIP and ZnT zinc transporters in human health and diseases. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3281-3295 (2014).
- Plum, L. M., Rink, L., Haase, H. The essential toxin: impact of zinc on human health. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (4), 1342-1365 (2010).
- Broun, E. R., Greist, A., Tricot, G., Hoffman, R. Excessive zinc ingestion. A reversible cause of sideroblastic anemia and bone marrow depression. Journal of the American Medical Association. 264 (11), 1441-1443 (1990).
- Fischer, P. W., Giroux, A., L’Abbe, M. R. The effect of dietary zinc on intestinal copper absorption. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (9), 1670-1675 (1981).
- Ogiso, T., Ogawa, N., Miura, T. Inhibitory effect of high dietary zinc on copper absorption in rats. II. Binding of copper and zinc to cytosol proteins. in the intestinal mucosa. Chemical and Pharmaceutical Bulletin (Tokyo. 27 (2), 515-521 (1979).
- Gaetke, L. M., Chow, C. K. Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology. 189 (1-2), 147-163 (2003).
- Macomber, L., Imlay, J. A. The iron-sulfur clusters of dehydratases are primary intracellular targets of copper toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8344-8349 (2009).
- Robotham, J. L., Lietman, P. S. Acute iron poisoning. A review. American Journal of Diseases of Children. 134 (9), 875-879 (1980).
- Yang, W., Ni, Z., Guang, P., Xue, Y., Guang, P., Fen, X. . Recent advances in absolute analysis by graphite furnace atomic absorption spectrometry. 17 (2), 104-110 (1997).
- Gomez-Nieto, B., Gismera, M. J., Sevilla, M. T., Satrustegui, J., Procopio, J. R. Micro-sampling method based on high-resolution continuum source graphite furnace atomic absorption spectrometry for calcium determination in blood and mitochondrial suspensions. Talanta. 170, 15-21 (2017).
- Shaw, J. C., Bury, A. J., Barber, A., Mann, L., Taylor, A. A micromethod for the analysis of zinc in plasma or serum by atomic absorption spectrophotometry using graphite furnace. Clin Chim Acta. 118 (2-3), 229-239 (1982).
- Stevens, B. J., Hare, D. J., Volitakis, I., Cherny, R. A., Roberts, B. R. Direct determination of zinc in plasma by graphite furnace atomic absorption spectrometry using palladium/magnesium and EDTA matrix modification with high temperature pyrolysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 32 (4), 843-847 (2017).
- Durr, K. L., Tavraz, N. N., Spiller, S., Friedrich, T. Measuring cation transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus oocytes by atomic absorption spectrophotometry: an alternative to radioisotope assays. Journal of Visualized Experiments. (72), e50201 (2013).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Salto, R., et al. beta-Hydroxy-beta-Methylbutyrate (HMB) Promotes Neurite Outgrowth in Neuro2a Cells. PLoS One. 10 (8), e0135614 (2015).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Provost, P. Interpretation and applicability of microRNA data to the context of Alzheimer’s and age-related diseases. Aging (Albany NY). 2 (3), 166-169 (2010).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Padilla-Benavides, T., Velez-delValle, C., Marsch-Moreno, M., Castro-Munozledo, F., Kuri-Harcuch, W. Lipogenic Enzymes Complexes and Cytoplasmic Lipid Droplet Formation During Adipogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 117 (10), 2315-2326 (2016).
- Soule, H. D., et al. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Recherche en cancérologie. 50 (18), 6075-6086 (1990).
- Leighton, J., Estes, L. W., Mansukhani, S., Brada, Z. A cell line derived from normal dog kidney (MDCK) exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium. Cancer. 26 (5), 1022-1028 (1970).
- Cote, R. J. Aseptic technique for cell culture. Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Nabbi, A., Riabowol, K. Rapid Isolation of Nuclei from Cells In Vitro. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (8), 769-772 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Carpenter, M. C., Lo, M. N., Palmer, A. E. Techniques for measuring cellular zinc. Archive of Biochemistry and Biophysics. 611, 20-29 (2016).
- Paskavitz, A. L., et al. Differential expression of zinc transporters accompanies the differentiation of C2C12 myoblasts. Journal of Trace Elements in Medical Biology. 49, 27-34 (2018).
- Chandler, P., et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Molecular Cancer. 15 (2), (2016).
- Gordon, S. J. V., Fenker, D. E., Vest, K. E., Padilla-Benavides, T. Manganese influx and expression of ZIP8 is essential in primary myoblasts and contributes to activation of SOD2. bioRxiv. , 494542 (2018).
- Jansen, S., Arning, J., Beyersmann, D. Zinc homeostasis in C6 glioma cells: phospholipase C activity regulates cellular zinc export. Biological Trace Element Research. 108 (1-3), 87-104 (2005).
- Fahrni, C. J. Biological applications of X-ray fluorescence microscopy: exploring the subcellular topography and speciation of transition metals. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (2), 121-127 (2007).
- Huang, Z., Lippard, S. J. Illuminating mobile zinc with fluorescence from cuvettes to live cells and tissues. Methods in Enzymology. 505, 445-468 (2012).
- Qiao, W., Mooney, M., Bird, A. J., Winge, D. R., Eide, D. J. Zinc binding to a regulatory zinc-sensing domain monitored in vivo by using FRET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (23), 8674-8679 (2006).
- Tomat, E., Lippard, S. J. Imaging mobile zinc in biology. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 225-230 (2010).
- Jajda, H. M., et al. Comparative efficacy of two standard methods for determination of iron and zinc in fruits, pulses and cereals. Journal of Food Science and Technology. 52 (2), 1096-1102 (2015).
- Padilla-Benavides, T., Long, J. E., Raimunda, D., Sassetti, C. M., Argüello, J. M. A novel P1B-type Mn2+-transporting ATPase is required for secreted protein metallation in mycobacteria. Journal of Biological Chemistry. 288 (16), 11334-11347 (2013).
