Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.
Abstract
Die sich abzeichnende Rolle des Darmmikrobioms bei mehreren menschlichen Krankheiten erfordert einen Durchbruch neuer Werkzeuge, Techniken und Technologien. Solche Verbesserungen sind notwendig, um die Verwendung von Mikrobiom-Modulatoren für den Nutzen der menschlichen Gesundheit zu entschlüsseln. Das groß angelegte Screening und die Optimierung von Modulatoren zur Validierung der Mikrobiommodulation und zur Vorhersage der damit verbundenen gesundheitlichen Vorteile kann jedoch aufgrund der Notwendigkeit einer großen Anzahl von Tieren und/oder menschlichen Probanden praktisch schwierig sein. Zu diesem Zweck können In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle das vorläufige Screening von Mikrobiommodulatoren erleichtern. Hierin, Es ist optimiert und demonstriert ein ex vivo fäkale Mikrobiota Kultursystem, das für die Untersuchung der Auswirkungen der verschiedenen Interventionen von Darm-Mikrobiom-Modulatoren einschließlich Probiotika, Präbiotika und andere Lebensmittelzutaten verwendet werden kann, abgesehen von Nutraceuticals und Medikamente, über die Vielfalt und Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota. Inulin, eine der am häufigsten untersuchten präbiotischen Verbindungen und Mikrobiommodulatoren, wird hier als Beispiel verwendet, um seine Wirkung auf die gesunde fäkale Mikrobiotazusammensetzung und ihre metabolischen Aktivitäten, wie z. B. den pH-Wert von Fäkalien und den Fäkaliengehalte organischer Säuren, zu untersuchen. einschließlich Laktat und kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Das Protokoll kann für Studien nützlich sein, die darauf abzielen, die Auswirkungen verschiedener Interventionen von Modulatoren auf fäkale Mikrobiotaprofile abzuschätzen und ihre gesundheitlichen Auswirkungen vorherzusagen.
Introduction
Die menschliche Mikrobiota ist eine komplexe Gemeinschaft, die aus Bakterien, Archaeen, Viren und eukaryotischen Mikroben1besteht, die den menschlichen Körper innerlich und äußerlich bewohnen. Jüngste Erkenntnisse haben die grundlegende Rolle der Darmmikrobiota und des Darmmikrobioms (die gesamte Sammlung von Mikroben und deren Gene im menschlichen Magen-Darm-Trakt) bei verschiedenen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs1,2,3. Darüber hinaus produzieren die in unserem Darm lebenden Mikroorganismen ein breites Spektrum an Metaboliten, die unsere Gesundheit erheblich beeinträchtigen und auch zur Pathophysiologie mehrerer Krankheiten sowie einer Vielzahl von Stoffwechselfunktionen beitragen können4, 5. Abnorme Veränderungen (Störungen) in der Zusammensetzung und Funktion dieser darm mikrobiellen Population werden im Allgemeinen als “gut dysbiose” bezeichnet. Dysbiose ist in der Regel mit einem ungesunden Zustand des Hosts verbunden und kann daher von der normalen (patostatischen) mikrobiellen Gemeinschaft unterschieden werden, die mit einem gesunden Kontrollzustand des Hosts verbunden ist. Spezifische Muster der Darmmikrobiom Dysbiose sind oft in verschiedenen Krankheiten gefunden1,2,3,6,7.
Die Fermentation von unverdauten Lebensmitteln, insbesondere der fermentierbaren Kohlenhydrate/Fasern, durch die Darmmikrobiota liefert nicht nur Energie, sondern produziert auch divergierende Metaboliten wie kurzkettige Fettsäuren (SCFAs), Laktat, Formate, Kohlendioxid, Methan, Wasserstoff und Ethanol6. Darüber hinaus produziert die Darmmikrobiota auch eine Reihe anderer bioaktiver Substanzen wie Folat,Biotin, Trimethylamin-N-Oxid, Serotonin, Tryptophan, Gamma-Aminobuttersäure, Dopamin, Noradrenalin, Acetylcholin, Histamin, Desoxycholsäure und 4-Ethylphenylsulfat. Dies geschieht in erster Linie durch die Nutzung intrinsischer Stoffwechselflüsse innerhalb der Host-Mikroben-Nische, die zu mehreren Körperprozessen, Stoffwechselfunktionen und epigenetischen Veränderungenbeiträgt 1,8,9, 10. Die Auswirkungen verschiedener Eingriffe auf solche mikrobiellen Produkte bleiben jedoch aufgrund des Fehlens einfacher, effizienter und reproduzierbarer Protokolle unentdeckt oder unklar. Die Zusammensetzung der menschlichen Darmmikrobiota ist ein äußerst komplexes und vielfältiges Ökosystem, und daher bleiben viele Fragen über seine Rolle in der menschlichen Gesundheit und Krankheitspathologie unbeantwortet. Die Auswirkungen vieler gängiger Darmmikrobiommodulatoren (z.B. Probiotika, Präbiotika, Antibiotika, Fäkalientransplantationen und Infektionen) auf die Zusammensetzung und metabolische Funktionen der Darmmikrobiota bleiben weitgehend schwer fassbar. Darüber hinaus ist die Untersuchung und Validierung dieser Effekte in vivo schwierig, insbesondere weil die meisten Nährstoffe und Metaboliten, die von der Darmmikrobiota produziert werden, gleichzeitig und schnell im Darm absorbiert oder entsorgt werden; Daher bleibt die Messung der Produktion, Menge und Verarbeitung dieser Metaboliten (z. B. SCFAs) in vivo nach wie vor eine praktische Herausforderung. Tatsächlich sind physiologische Modelle wie Tiere und menschliche Probanden entscheidend für die Bestimmung der Rolle des Darmmikrobioms und seiner Modulation auf die Gesundheit des Wirts, aber diese sind möglicherweise nicht für großangelegte Screenings verschiedener Arten von Mikrobiommodulatoren aufgrund ethischen, monetären oder zeitlichen Zwängen. Zu diesem Zweck können In-vitro- und/oder Ex-vivo-Modelle, wie die Kultivierung von Darmmikrobiota in vitro und dann das Eingreifen mit verschiedenen Mikrobiota-Modulatoren, zeit- und kostensparende Möglichkeiten bieten und somit ein vorläufiges oder großangelegtes Screening von verschiedene Komponenten (wie Probiotika, Präbiotika, und andere interventionelle Verbindungen) zu untersuchen / ihre Auswirkungen auf die fäkale Mikrobiota Vielfalt zu untersuchen/ vorherzusagen. Studien, die solche In-vitro- und Ex-vivo-Systeme des Darmmikrobioms verwenden, können ein besseres Verständnis der Wirts-Mikrobiom-Wechselwirkungen erleichtern, die zur Gesundheit und Krankheit des Wirts beitragen, und könnten auch dazu führen, dass neuartige Therapien gefunden werden, die auf das Mikrobiom abzielen, um Gesundheit des Wirts zu verbessern und verschiedene Krankheiten zu verhindern und zu behandeln1.
Obwohl die In-vitro-Darm-Mikrobiota-Kultursysteme die tatsächlichen Darmerkrankungen nicht wirklich replizieren können, haben sich mehrere Laboratorien bemüht, solche Modelle zu entwickeln, von denen einige bis zu einem gewissen Grad praktikabel wurden und erfolgreich für verschiedenen Zwecken. Eines der jüngsten Darmmodelle ist der Simulator des Human Intestinal Microbial Ecosystem, das den gesamten menschlichen Magen-Darm-Trakt imitiert, einschließlich des Magens, dünndarm, und verschiedene Regionen des Dickdarms. Solche technisch komplexen Modelle sind jedoch möglicherweise nicht für andere Forschungseinrichtungen weltweit zugänglich. Daher besteht nach wie vor ein kritischer Bedarf an der Entwicklung neuer alternativer Modelle, die relativ einfach, erschwinglich und praktisch für Laboratorien sind, die die Mikrobiommodulatoren und ihre Auswirkungen auf Darmmikrobiota und wirtsgesundheit untersuchen. Daher wäre die Verwendung eines in vitro (oder ex vivo) fäkalen Mikrobiota-Kultursystems nützlich, um die Auswirkungen solcher Interventionen zu untersuchen11,12. Insbesondere kann die Wirkung verschiedener Präbiotika auf die Mikrobiota-Fermentationskapazität in Bezug auf periodische Veränderungen in der Darmmikrobiota-Vielfalt und -Zusammensetzung, dem pH-Wert von Fäkalien und dem Gehalt an mikrobiellen Metaboliten, einschließlich SCFAs und Laktat, untersucht werden. 13. Hierin wird unter Verwendung von Inulin (einer der am häufigsten untersuchten präbiotischen Komponenten) als Beispiel für den Mikrobiommodulator ein Schritt-für-Schritt-Protokoll dieses einfachen ex vivo Mikrobiota-Batchkultursystems beschrieben, um seine Verwendung zur Schätzung der Veränderungen der fäkalen Mikrobiota und mikrobiellen Metaboliten nach Intervention mit den Mikrobiommodulatoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier vorgestellte In-vitro-Fäkalien-Gärungsmodell ist ein einfaches Einzel-Batch-Modell, um die Auswirkungen verschiedener Substrate und mikrobiellen Stämme (z. B. Präbiotika und Probiotika) auf die Zusammensetzung der menschlichen Fäkalmikrobiota sowie deren Metabolische Aktivitäten in Bezug auf den pH-Wert und die SCFAs-Spiegel. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Inokulation von Inulin den pH-Wert des Fäkalien verringert und die SCFAs und laktatiniert in inulin behandelten Fäkalien im Vergle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Förderung durch das Center for Diabetes, Adipositas and Metabolism und das Clinical and Translational Science Center, die Wake Forest School of Medicine, die Finanzierung des Department of Defense (Grant-Nummer: W81XWH-18-1-0118), kermit Glenn Phillips II Lehrstuhl für Herz-Kreislauf-Medizin; die National Institutes of Health finanziert Claude D. Pepper Older Americans Center (finanziert von P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 und das Clinical and Translational Science Center (Clinical Research Unit, finanziert von UL1TR001420) werden ebenfalls dankend anerkannt. Wir danken auch den Freiwilligen für die Bereitstellung von Fäkalienproben und unseren anderen Labormitgliedern für ihre technische Hilfe während dieses Experiments.
Materials
| Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 217255 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | TGI | C2388 | Toxic |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Irritating |
| Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) | Acros organics | 2063450000 | Toxic, Irritating |
| Cysteine-HCl | Sigma-Aldrich | C121800 | |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| D-Pantothenic acid | Alfa Aesar | A16609 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) | Biorad | 1610729 | |
| DL-α-methylbutyrate | Sigma-Aldrich | W271918 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | F8263 | Toxic |
| Folic acid | Alfa Aesar | J62937 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
| Hepes | Alfa Aesar | A14777 | |
| Isobutyrate | Alfa Aesar | L04038 | |
| Isovalerate | Alfa Aesar | A18642 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Niacin (Nicotinic acid) | Sigma-Aldrich | N4126 | |
| Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) | Alfa Aesar | A14366 | Toxic |
| N-valerate | Sigma-Aldrich | 240370 | |
| P-aminobenzoic acid | MP China | 102569 | Toxic, Irritating |
| Phosphoric Acid (H3PO4) | Sigma-Aldrich | P5811 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5504 | |
| Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | 1551128 | |
| Pyridoxine | Alfa Aesar | A12041 | |
| Resazurin | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Riboflavin | Alfa Aesar | A11764 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | 1613757 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher BioReagents | 7647-14-5 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Chemicals | S320 | |
| Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) | Acros organics | 206375000 | |
| Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) | Acros organics | 148991000 | |
| Trypticase | BD Biosciences | 211921 | |
| Vitamin B12 | Sigma-Aldrich | V2876 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161 | |
| Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 0.22 µm membrane filter | |||
| AMPure magnetic purification beads | Agencourt | ||
| Anaerobic chamber with incubatore | Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA | ||
| Bottle filter | Corning | ||
| Cheesecloth | |||
| Illumina MiSeq sequencer | Miseq reagent kit v3 | ||
| pH meter | |||
| Qiagen PowerFecal kit | Qiagen | ||
| Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software | |||
| Qubit-3 fluorimeter | InVitrogen | ||
| Vortex | Thermoscientific | ||
| Waters-2695 Alliance HPLC system | Waters Corporation |
References
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