Summary

En in vitro-modell för att uppskatta effekterna av interventionella regimer på human fekal Microbiota

Published: July 31, 2019
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver ett in vitro-system för jäsning av Human fekal bakterieflora, med hjälp av inulin (en välkänd prebiotika och en av de mest studerade Mikrobiota modulatorer) för att demonstrera användningen av detta system för att uppskatta effekterna av specifika interventioner på fekal bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter.

Abstract

Den framväxande roll Gut mikrobiomet i flera mänskliga sjukdomar kräver ett genombrott av nya verktyg, tekniker och teknik. Sådana förbättringar behövs för att dechiffrera utnyttjandet av mikrobiomet modulatorer för människors hälsa fördelar. Men den storskaliga screening och optimering av modulatorer för att validera mikrobiomet modulering och förutsäga relaterade hälsofördelar kan vara praktiskt taget svårt på grund av behovet av ett stort antal djur och/eller försökspersoner. För detta ändamål kan in vitro-eller ex vivo-modeller underlätta preliminär screening av mikrobiomet modulatorer. Häri, det är optimerat och visat en ex vivo fekal bakterieflora kultur system som kan användas för att undersöka effekterna av olika ingrepp i Gut mikrobiomet modulatorer inklusive probiotika, prebiotika och andra livsmedelsingredienser, bortsett från nutraceuticals och droger, om mångfalden och sammansättningen av den mänskliga Gut bakterieflora. Inulin, en av de mest studerade prebiotiska föreningar och mikrobiomet modulatorer, används som ett exempel här för att undersöka dess effekt på friska fekal bakterieflora sammansättning och dess metaboliska aktiviteter, såsom fekal pH och fekal nivåer av organiska syror inklusive laktat och kortkedjiga fettsyror (SCFAs). Protokollet kan vara användbart för studier som syftar till att uppskatta effekterna av olika interventioner av modulatorer på fekal bakterieflora profiler och att förutsäga deras hälsoeffekter.

Introduction

Den mänskliga bakterieflora är en komplex gemenskap bestående av bakterier, Archaea, virus och eukaryota mikrober1, som lever i den mänskliga kroppen internt och externt. De senaste bevisen har fastställt den grundläggande roll som Gut bakterieflora och Gut mikrobiomet (hela samlingen av mikrober och deras gener som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen) i olika mänskliga sjukdomar, inklusive fetma, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar och cancer1,2,3. Dessutom, de mikroorganismer som lever i vår Gut producera ett brett spektrum av metaboliter som signifikant påverkar vår hälsa och kan också bidra till patofysiologin av flera sjukdomar samt en mängd metabola funktioner4, 5. onormala förändringar (perturbationer) i sammansättningen och funktionen av denna Gut mikrobiella populationen betecknas allmänt som “Gut dysbios”. Dysbios är vanligtvis förknippad med ett ohälsosamt tillstånd av värden och därmed kan skiljas från den normala (homeostatiska) mikrobiell gemenskap som är associerad med en hälsosam kontroll tillstånd av värden. Specifika mönster av Gut mikrobiomet dysbios finns ofta i olika olika sjukdomar1,2,3,6,7.

Jäsning av osmält mat, särskilt jäsbara kolhydrater/fibrer, genom tarmen bakterieflora inte bara ger energi utan också producerar olika metaboliter inklusive kortkedjiga fettsyror (scfas), laktat, formate, koldioxid, metan, väte och etanol6. Dessutom, den Gut bakterieflora producerar också ett antal andra bioaktiva substanser såsom folat, biotin, trimethylamine-N-oxid, serotonin, tryptofan, gamma-aminosmörsyra, dopamin, noradrenalin, acetylkolin, histamin, deoxycholsyra och 4-etylfenylsulfat. Detta sker främst genom utnyttjande av inneboende metaboliska flöden inom värd-Microbe nisch, som bidrar i flera kroppens processer, metaboliska funktioner och epigenetiska förändringar1,8,9, 10. Effekterna av olika interventioner på sådana mikrobiella produkter förblir dock otydliga eller oklara på grund av bristen på enkla, effektiva och reproducerbara protokoll. Sammansättningen av Human Gut bakterieflora är ett mycket komplext och mångsidigt ekosystem, och därför är många frågor om dess roll i människans hälsa och sjukdoms patologi fortfarande obesvarade. Effekterna av många vanliga Gut mikrobiomet modulatorer (t. ex., probiotika, prebiotika, antibiotika, fekal transplantation och infektioner) på sammansättningen och metaboliska funktioner i tarmbakterieflora fortfarande i stort sett svårfångade. Dessutom är det svårt att undersöka och validera dessa effekter in vivo, särskilt eftersom de flesta av de näringsämnen och metaboliter som produceras i tarmfloran absorberas eller bortskaffas samtidigt och snabbt i tarmen. Därför är det fortfarande en praktisk utmaning att mäta produktionen, mängden och bearbetningen av dessa metaboliter (t. ex. SCFAs) in vivo. Faktum är att fysiologiska modeller som djur och försökspersoner är avgörande för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet och dess modulering på värd hälsan, men dessa kanske inte lämpar sig för storskalig screening av olika typer av mikrobiomet modulatorer på grund av etiska, monetära eller tidsbegränsningar. I detta syfte kan in vitro-och/eller ex vivo-modeller, såsom odling av tarmfloran in vitro och sedan ingripa med olika Mikrobiota-modulatorer, erbjuda tids-och penga sparande möjligheter och kan därför möjliggöra preliminär eller storskalig screening av olika komponenter (såsom probiotika, prebiotika, och andra interventionella föreningar) att undersöka/förutsäga deras effekter på fekal bakterieflora mångfald, sammansättning och metabola profiler. Studier som använder sådana in vitro-och ex vivo-system i tarmen mikrobiome kan underlätta ytterligare förståelse av värd-mikrobiomet interaktioner som bidrar till värd hälsa och sjukdom, och kan också leda till att hitta nya terapier som riktar sig till mikrobiomet att förbättra värd hälsa och förebygga och behandla olika sjukdomar1.

Även om kultur systemen in vitro Gut bakterieflora inte riktigt kan replikera de faktiska tarm förhållandena har flera laboratorier strävat efter att utveckla sådana modeller, av vilka några har hittats praktiskt i viss utsträckning och har använts framgångsrikt för olika ändamål. En av de senaste Gut modellerna är simulatorn av människans intestinal mikrobiella ekosystem, som härmar hela människans mag-tarmkanalen, inklusive magen, tunntarm, och olika regioner i tjocktarmen. Sådana tekniskt komplicerade modeller kan dock inte vara tillgängliga för andra forskningsanläggningar över hela världen. Därför finns det fortfarande ett kritiskt behov av utveckling av nya alternativa modeller som är relativt enkla, överkomliga och praktiska för laboratorier som studerar mikrobiomet modulatorer och deras effekter på tarmfloran och värd hälsan. Därför skulle användningen av ett in vitro-(eller ex vivo) fekalt Mikrobiota-kultursystem vara användbart för att studera effekterna av sådana interventioner11,12. Specifikt, effekten av olika prebiotika på bakterieflora jäsning kapacitet i form av periodiska förändringar i tarmfloran mångfald och sammansättning, fekal pH, och nivåerna av mikrobiella metaboliter inklusive SCFAs och laktat kan studeras 13. häri, med hjälp av inulin (en av de mest studerade prebiotiska komponenter) som ett exempel på mikrobiomet modulator, ett steg-för-steg-protokoll i detta enkla ex vivo bakterieflora batch-kultursystem beskrivs för att visa dess användning för att uppskatta förändringar i fekal bakterieflora och mikrobiella metaboliter efter intervention med mikrobiomet modulatorer.

Protocol

FÖRSIKTIGHET: konsultera lämpliga material säkerhets data blad och följ instruktionerna och riktlinjerna för lämplig utbildning i biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2). Följ alla odlings stegen enligt de vanliga biosäkerhets reglerna och Använd ett BSL-2-skåp med aseptiska förhållanden. Dessutom kan fekala prover från olika modeller och försökspersoner ha potentiell risk för spridning av mikrobiella sjukdomar. Omedelbart söka medicinsk hjälp i händelse av skada och infektion. Dessutom bör användningen av avf?…

Representative Results

Protokollet används för att påvisa effekten av en specifik prebiotiska (dvs inulin på bakterieflora sammansättning och metaboliska aktiviteter i form av förändringar i fekal pH och koncentrationen av laktat och SCFAs i avföring från friska försökspersoner över olika tidpunkter efter behandling med inulin). Fekal pH, fekal nivåer av laktat och SCFAs (figur 1), och sammansättningen av bakterieflora (figur 2 och <stron…

Discussion

Den in vitro fekal flytgödsel jäsning modell som presenteras här är en enkel enda sats modell för att approximera effekterna av olika substrat och mikrobiella stammar (t. ex., prebiotika och probiotika) på sammansättningen av mänskliga fekal bakterieflora samt dess metaboliska aktiviteter i form av fekal pH och SCFAs nivåer. De resultat som presenteras häri visar att inympningen av inulin minskar fekal pH och signifikant ökar nivåerna av SCFAs och laktat i inulin-behandlade fekal prov jämfört med icke-behan…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner tacksamt finansiering stöd från centrum för diabetes, fetma och metabolism och den kliniska och translationella Science Center, Wake Forest School of Medicine, Department of Defense finansiering (Grant Number: W81XWH-18-1-0118), den Kermit Glenn Phillips II stol i kardiovaskulär medicin; de nationella instituten för hälso-finansierade Claude D. Pepper äldre amerikaner Center (finansierat av P30AG12232); R01AG18915; R01DK114224 och den kliniska och translationella Science Center (klinisk forskningsenhet, finansierad av UL1TR001420), är också tack och lov erkänt. Vi tackar också volontärer för att tillhandahålla fekal prover, och våra andra Lab medlemmar för deras tekniska hjälper under detta experiment.

Materials

Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

References

  1. Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
  2. Xu, Z., Knight, R. Dietary effects on human gut microbiome diversity. British Journal of Nutrition. 113, 1-5 (2015).
  3. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The gut microbiota and Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimers Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  4. Clemente, J. C., Ursell, L. K., Parfrey, L. W., Knight, R. The impact of the gut microbiota on human health: an integrative view. The Journal Cell. 148 (6), 1258-1270 (2012).
  5. Yadav, H., Jain, S., Marotta, F. Probiotics mediated modulation of gut flora might be biotherapeutical approach obesity and type 2 diabetes. Metabolomics : Open Access. 1 (3), 1-3 (2011).
  6. Ahmadi, S., et al. Dietary Polysaccharides in the Amelioration of Gut Microbiome Dysbiosis and Metabolic Diseases. Obesity and Control Theries: Open Access. 4 (3), (2017).
  7. Nagpal, R., et al. Obesity-Linked Gut Microbiome Dysbiosis Associated with Derangements in Gut Permeability and Intestinal Cellular Homeostasis Independent of Diet. Journal of Diabetes Research. , 1-9 (2018).
  8. Paul, B., et al. Influences of diet and the gut microbiome on epigenetic modulation in cancer and other diseases. Journal of Clinical Epigenetics. 7 (1), 112 (2015).
  9. O’mahony, S., Clarke, G., Borre, Y., Dinan, T., Cryan, J. Serotonin tryptophan metabolism and the brain-gut-microbiome axis. Journal of Behavioural Brain Research. 277, 32-48 (2015).
  10. Sharon, G., et al. Specialized metabolites from the microbiome in health and disease. Journal of Cell Metabolism. 20 (5), 719-730 (2014).
  11. Faber, T. A., Bauer, L. L., Price, N. P., Hopkins, A. C., Fahey, G. C. In vitro digestion and fermentation characteristics of temulose molasses, a coproduct of fiberboard production, and select temulose fractions using canine fecal inoculum. Journal of Agricultural Food Chemistry. 59 (5), 1847-1853 (2011).
  12. Bourquin, L. D., Titgemeyer, E. C., Fahey, G. C. Vegetable fiber fermentation by human fecal bacteria: cell wall polysaccharide disappearance and short-chain fatty acid production during in vitro fermentation and water-holding capacity of unfermented residues. Journal of Nutrition. 123 (5), 860-869 (1993).
  13. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short-chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649 (2018).
  14. Nagpal, R., et al. Comparative microbiome signatures and short-chain fatty acids in mouse, rat, non-human primate and human feces. Frontiers in Microbiology. 9, 2897 (2018).
  15. Thangamani, S., Guinan, J., Wang, S., Yadav, H. Antibiotic-induced decreases in the levels of microbial-derived short-chain fatty acids promote gastrointestinal colonization of Candida albicans. bioRxiv. , 428474 (2018).
  16. Ahmadi, S., et al. Prebiotics from acorn and sago prevent high-fat diet-induced insulin resistance via microbiome-gut-brain axis modulation. The Journal of Nutritional Biochemistry. , (2019).
  17. Nagpal, R., et al. Gut Microbiome Composition in Non-human Primates Consuming a Western or Mediterranean Diet. Frontiers in Nutrition. 5, 28 (2018).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME Journal. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  19. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  20. Garcia-Villalba, R., et al. Alternative method for gas chromatography-mass spectrometry analysis of short-chain fatty acids in faecal samples. Journal of Seperation Science. 35 (15), 1906-1913 (2012).
  21. Lee, C. H., et al. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile Infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  22. Chen, M. -. H., et al. In vitro fermentation of xylooligosaccharides produced from Miscanthus× giganteus by human fecal microbiota. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64 (1), 262-267 (2015).
  23. Cook, S., Sellin, J. Short chain fatty acids in health and disease. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 12 (6), 499-507 (1998).
  24. Rastelli, M., Knauf, C., Cani, P. D. Gut microbes and health: a focus on the mechanisms linking microbes, obesity, and related disorders. Obesity. 26 (5), 792-800 (2018).
  25. Zou, J., et al. Fiber-mediated nourishment of gut microbiota protects against diet-induced obesity by restoring IL-22-mediated colonic health. Cell Host & Microbe. 23 (1), 41-53 (2018).
  26. Dinan, T. G., Cryan, J. F. Gut–brain axis in 2016: Brain–gut–microbiota axis—mood, metabolism and behaviour. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 69 (2017).
check_url/fr/59524?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

View Video