प्रोटीन Kinase कल्पना एक गतिविधि में सिर तय व्यवहार चूहे Vivo दो-फोटोन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी में उपयोग
Summary
एक प्रक्रिया प्रोटीन kinase एक गतिविधियों सिर में निर्धारित, चूहों व्यवहार की कल्पना करने के लिए प्रस्तुत किया है. एक बेहतर ए-किनेज़ गतिविधि संवाददाता, tAKAR, cortical न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है और एक कपाल खिड़की के माध्यम से इमेजिंग के लिए सुलभ बनाया. दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी लागू चलन के दौरान विवो में पीकेए गतिविधियों की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
Abstract
तंत्रिकामॉडुलन मस्तिष्क समारोह पर शक्तिशाली नियंत्रण डालती है। न्यूरोमॉड्यूलेटरी सिस्टम के रोग मस्तिष्क संबंधी और मनोरोग विकारों में परिणाम. उनके महत्व के बावजूद, सेलुलर संकल्प के साथ neuromodulatory घटनाओं पर नज़र रखने के लिए प्रौद्योगिकियों बस उभरने लगे हैं. Neuromodulators, जैसे डोपामाइन, norepinephrine, acetylcholine, और सेरोटोनिन, उनके संबंधित जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के माध्यम से intracellular संकेतन घटनाओं को ट्रिगर करने के लिए न्यूरॉन उत्तेजक उत्तेजना, synaptic संचार, और अन्य न्यूरॉन कार्य करता है, जिससे न्यूरोनल नेटवर्क में सूचना संसाधन को विनियमित. उपर्युक्त न्यूरोमॉड्यूलेटर कैम्प/प्रोटीन किनेज ए (पीकेए) मार्ग पर अभिसरित होते हैं। इसलिए, एकल सेल संकल्प के साथ विवो पीकेए इमेजिंग में न्यूरोमॉड्यूलेटरी घटनाओं के लिए न्यूरोनल विद्युत गतिविधियों के लिए कैल्शियम इमेजिंग के अनुरूप तरीके से एक रीडआउट के रूप में विकसित किया गया था। इसमें, एक विधि सिर तय व्यवहार चूहों के प्रांतस्था में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर पर PKA गतिविधि कल्पना करने के लिए प्रस्तुत किया है. ऐसा करने के लिए, एक बेहतर ए-kinase गतिविधि रिपोर्टर (AKAR), tAKAR$ कहा जाता है, प्रयोग किया जाता है, जो F$rster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) पर आधारित है. यह आनुवंशिक रूप से एनकोडेड पीकेए सेंसर को डीएनए प्लाज्मिड के यूटेरो इलेक्ट्रोपोट्रेशन (आईयूई) या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के माध्यम से मोटर कॉर्टेक्स में पेश किया जाता है। FRET परिवर्तन दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (2pFLIM) का उपयोग कर छवि बनाई जाती है, जो प्रकाश-स्कैटिंग मस्तिष्क के ऊतकों में FRET संकेत की मात्रा के लिए अनुपातमीट्रिक FRET माप से अधिक लाभ प्रदान करता है। लागू चलन के दौरान PKA गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए, tAKAR$ जाग के प्रांतस्था के ऊपर एक पुरानी कपाल खिड़की के माध्यम से छवि है, सिर तय चूहों, जो चलाने के लिए या एक गति नियंत्रित मोटर चालित ट्रेडमिल पर आराम. इस इमेजिंग दृष्टिकोण इसी व्यवहार प्रेरित PKA गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए कई अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए लागू हो जाएगा और अन्य FLIM आधारित सेंसर के लिए विवो इमेजिंग में.
Introduction
न्यूरोमॉडुलन, जिसे धीमी गति से सिंपटिक ट्रांसमिशन के रूप में भी जाना जाता है, विभिन्न व्यवहार राज्यों के दौरान मस्तिष्क समारोह पर मजबूत नियंत्रण लगाता है, जैसे तनाव, कामोत्तेजना, ध्यान, और चलन1,2,3, 4.इसके महत्व के बावजूद, कब और कहाँ neuromodulatory घटनाओं जगह ले का अध्ययन अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है. acetylcholine सहित neuromodulators, डोपामाइन, noradrenaline, सेरोटोनिन, और कई neuropeptides, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) को सक्रिय, जो बारी में ट्रिगर intracellular दूसरा दूत रास्ते समय स्केल की एक विस्तृत खिड़की के साथ सेकंड से घंटे के लिए. जबकि प्रत्येक न्यूरोमोड्यूलेटर संकेतन घटनाओं का एक विशिष्ट सेट ट्रिगर करता है, सीएएमपी/प्रोटीन किनेज़ ए(पीकेए) मार्ग कई न्यूरोमॉड्यूलेटर 1,5के लिए एक आम डाउनस्ट्रीम मार्ग है। CAMP/PKA मार्ग न्यूरॉन उत्तेजकता को नियंत्रित करता है, synaptic संचरण, और plasticity6,7,8,9, और इसलिए, न्यूरॉन नेटवर्क गतिशीलता धुनों. क्योंकि विभिन्न न्यूरॉन्स या न्यूरॉन विभिन्न प्रकार या neuromodulator रिसेप्टर्स के स्तर को व्यक्त10, एक ही extracellular neuromodulator के intracellular प्रभाव विभिन्न न्यूरॉन्स भर में विषम हो सकता है, और इस प्रकार, होना चाहिए सेलुलर संकल्प के साथ अध्ययन किया. तारीख करने के लिए, यह व्यवहार के दौरान vivo में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में neuromodulatory घटनाओं पर नजर रखने के लिए चुनौतीपूर्ण रहता है.
neuromodulation के spatiotemporal गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक उपयुक्त रिकॉर्डिंग मोडलिटी की आवश्यकता है। माइक्रोडायलिसिस और फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टमिति का उपयोग अक्सर न्यूरोमॉड्यूलेटरों की रिहाई का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, लेकिन वे सेलुलर घटनाओं11,12पर नजर रखने के लिए स्थानिक संकल्प की कमी करते हैं। जनसंख्या इमेजिंग में न्यूरॉन विद्युत गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा कैल्शियम गतिशीलता के अनुरूप13,PKA इमेजिंग सेलुलर संकल्प पर एक न्यूरॉन आबादी भर में neuromodulatory घटनाओं को पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल पशु व्यवहार के दौरान vivo में PKA गतिविधियों पर नजर रखने के लिए एक बेहतर A-kinase गतिविधि रिपोर्टर (AKAR) के उपयोग का वर्णन करता है। यहाँ वर्णित विधि एक अस्थायी संकल्प है कि शारीरिक neuromodulatory घटनाओं पटरियों के साथ subcellular संकल्प पर न्यूरॉन आबादी के एक साथ इमेजिंग के लिए अनुमति देता है.
AKARs एक दाता और एक स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बना रहे हैं एक PKA फॉस्फोरिलेशन सब्सट्रेट पेप्टाइड और एक फोर्कहेड संबद्ध (FHA) डोमेनहै कि सब्सट्रेट के फॉस्फोरीलेटिड serine या threonine के लिए बांधता है 14,15. PKA मार्ग के सक्रियण पर, AKAR के सब्सट्रेट पेप्टाइड फॉस्फोरीलेटाइज्ड है. नतीजतन, FHA डोमेन फॉस्फोरीलेट सब्सट्रेट पेप्टाइड को बांधता है, जिससे दो फ्लोरोफोर्स को निकट निकटता में लाना, जिसे AKAR की बंद स्थिति के रूप में संदर्भित किया जाता है। दाता और ग्राही फ्लोरोफोर्स के बीच एक फॉस्फोरिलेटा हुआ AKAR की बंद अवस्था का परिणाम बढ़ जाता है। चूंकि फॉस्फोरिलेट्ड AKARs का अनुपात पीकेए गतिविधि16के स्तर से संबंधित है , इसलिए जैविक नमूने में FRET की मात्रा का उपयोग PKA गतिविधि16,17,18के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, 19,20.
AKARs के प्रारंभिक संस्करण मुख्य रूप से दो रंग अनुपात मिट्रिक इमेजिंग14के लिए डिजाइन किए गए थे। जब मस्तिष्क के ऊतकों में गहराई से इमेजिंग, अनुपातमेट्रिक विधि तरंगदैर्ध्य पर निर्भर प्रकाश प्रकीर्णन17,18,21के कारण संकेत विरूपण से ग्रस्त है। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) इस समस्या को समाप्त करता है क्योंकि FLIM केवल दाता फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों के उपाय18,21. परिणामस्वरूप, FRET के फ़्लाय परिमाणीकरण ऊतक-गहराई17से प्रभावित नहीं होता है। इसके अलावा, एक “अंधेरे” (यानी, कम क्वांटम उपज [QY]) स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के संस्करण का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक रंग चैनल को मुक्त करता है ताकि दूसरे संवेदक या एक आकृतिक मार्कर17,19,20के एक साथ इमेजिंग के माध्यम से ऑर्थोगोनल न्यूरोनल गुणों के बहुसंकेतित माप को सुविधाजनक बनाया जा सके .
FLIM इमेजिंग समय है कि एक फ्लोरोफोर उत्तेजित राज्य में खर्च करता है, अर्थात्, फ्लोरोसेंट जीवनकाल18की मात्रा निर्धारित करता है. जमीन राज्य के लिए एक फ्लोरोफोर की वापसी, इस प्रकार उत्साहित राज्य के अंत, अक्सर एक फोटॉन के उत्सर्जन के साथ सहवर्ती. हालांकि एक व्यक्ति उत्साहित अणु के लिए एक फोटॉन के उत्सर्जन stochastic है, एक जनसंख्या में मतलब फ्लोरोसेंट जीवनकाल है कि विशेष रूप से फ्लोरोफोर की एक विशेषता है. जब फ्लोरोफोर की एक शुद्ध आबादी एक साथ उत्साहित कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट एक भी घातीय क्षय का पालन करेंगे. इस घातीय क्षय के समय स्थिरक मतलब फ्लोरोसेंट जीवनकाल, जो आम तौर पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक से चार नैनोसेकंड के लिए पर्वतमाला से मेल खाती है. एक उत्साहित दाता फ्लोरोफोर की जमीन राज्य में वापसी भी FRET द्वारा हो सकता है. FRET की उपस्थिति में, दाता फ्लोरोफोर के फ्लोरोसेंट जीवनकाल कम हो जाता है। Unphosphorylated AKARs एक अपेक्षाकृत लंबे समय तक दाता फ्लोरोसेंट जीवनकाल प्रदर्शन. PKA द्वारा फॉस्फोरिलेशन पर, सेंसर एक छोटे जीवनकाल दर्शाती है क्योंकि दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर एक दूसरे के पास लाया जाता है और FRET बढ़ जाती है। AKARs की आबादी में फ्लोरोसेंट जीवनकाल के परिमाण इसलिए PKA गतिविधि के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है.
AKARs के प्रारंभिक संस्करणों को एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर विवो इमेजिंग में सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है. यह मुख्य रूप से शारीरिक सक्रियणों के लिए AKAR सेंसर के कम संकेत आयाम के कारणहै 17. हाल ही में, व्यवस्थित दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (2pFLIM) के लिए उपलब्ध AKAR सेंसर की तुलना करके, FLIM-AKAR नामक एक सेंसर वैकल्पिक सेंसरों को बेहतर प्रदर्शन करने के लिए पाया गया था। इसके अलावा, FLIM-AKAR वेरिएंट की एक श्रृंखला लक्षित AKARs (tAKARs) कहा जाता है विशिष्ट subcellular स्थानों पर पीकेए गतिविधि कल्पना करने के लिए विकसित किए गए थे: microtubules (tAKAR$), साइटोसोल (tAKAR]), actin (tAKAR]), फिलामेंटस actin (tAKAR ]), झिल्ली (tAKAR], और पोस्टिनैप्टिक घनत्व (tAKAR $). तकाकरों में, टाकाआर ने नोरेपिनेफ्रिन द्वारा प्राप्त सिग्नल आयाम को 2.7 गुना बढ़ा दिया। यह इस ज्ञान के अनुरूप है कि न्यूरॉन्स में पीकेए के अधिकांश हिस्से को आराम की अवस्था22,23में माइक्रोट्यूल्स में लगाया जाता है . 2PFLIM के लिए मौजूदा AKARs के बीच tAKAR$ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, tAKAR] कई neuromodulators द्वारा प्राप्त शारीरिक रूप से प्रासंगिक पीकेए गतिविधि का पता चला, और tAKAR की अभिव्यक्ति न्यूरॉन कार्यों17में परिवर्तन नहीं किया.
हाल ही में, tAKAR] सफलतापूर्वक सिर में PKA गतिविधियों की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था तय व्यवहार चूहों17. यह दिखाया गया था कि लागू चलन सतही परत न्यूरॉन्स की सोमा में PKA गतिविधि ट्रिगर (परत 1 से 3, pia से $ 300 की गहराई तक) मोटर, बैरल में, और दृश्य cortices. चलन-ट्रिगर PKA गतिविधि भाग में था $-adrenergic रिसेप्टर्स और D1 डोपामाइन रिसेप्टर्स के माध्यम से संकेत पर निर्भर है, लेकिन एक D2 डोपामाइन रिसेप्टर विरोधी द्वारा प्रभावित नहीं था. यह काम 2pFLIM का उपयोग कर vivo में neuromodulation घटनाओं को ट्रैक करने के लिए tAKARs की क्षमता दिखाता है.
वर्तमान प्रोटोकॉल में, PKA गतिविधि इमेजिंग के लिए पूरी विधि सिर में तय जाग चूहों एक लागू चलन प्रतिमान के दौरान छह चरणों में वर्णित है. सबसे पहले, एक पारंपरिक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप के लिए 2pFLIM क्षमताओं के अलावा (चित्र 1). दूसरा, मोटर चालित ट्रेडमिल का निर्माण (चित्र2)। तीसरा, डीएनए प्लाज्मिड के यूटेरो इलेक्ट्रोपोरेशन (आईयूई) में, या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन द्वारा माउस कॉर्टेक्स में टीएकेआर सेंसर की अभिव्यक्ति। IUE24,25 और वायरल कणों के stereotaxic इंजेक्शन के लिए सर्जरी के लिए उत्कृष्ट प्रोटोकॉल26 पहले प्रकाशित किया गया है. कुंजी पैरामीटर हम इस्तेमाल किया नीचे वर्णित हैं. फोर्थ, एक कपाल खिड़की की स्थापना. उत्कृष्ट प्रोटोकॉल पहले कपाल खिड़की सर्जरी27,28के लिए प्रकाशित किया गया है . मानक प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है जो कई चरणों का वर्णन किया गया है। पांचवें, vivo 2pFLIM में प्रदर्शन. छठी, 2pFLIM छवियों का विश्लेषण (चित्र3 और चित्र 4)। इस दृष्टिकोण को आसानी से कई अन्य सिर तय व्यवहार प्रतिमानों और मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए लागू किया जाना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल FRET-FLIM सेंसर tAKAR के उपयोग को दर्शाता है सिर तय व्यवहार चूहों में neuromodulation-ट्रिगर PKA गतिविधि कल्पना करने के लिए. यह आवेदन विस्तृत परीक्षण और इन विट्रो में और विवो में की विशेषताओं पर आधारित है कि प्र…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सुश्री Tess जे Lameyer, सुश्री रूथ फ्रैंक, और संपादन और टिप्पणियों के लिए डॉ माइकल ए मुनीक धन्यवाद, और डॉ Ryohei Yasuda मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा में 2pFLIM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए. यह काम दो ब्राइन पहल पुरस्कार U01NS094247 (H.$. और T.M.) और R01NS1049444 (H.$. और T.M.), एक R01NS081071 (T.M.), और एक R21 अनुदान R21NS097856 (H.M.) द्वारा समर्थित किया गया था. सभी पुरस्कार राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक, संयुक्त राज्य अमेरिका के संस्थान से हैं.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
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