Оценка «локализация ядра» и «культурное целостность» Зебрая
Summary
Эти протоколы были разработаны для анализа морфологии коры головного хрусталика, структурную целостность швами рыбы данио рерио в фиксированных и живых линз и для измерения положения ядра рыбы объектива данио, по передней задней оси.
Abstract
В данио рыба уникально подходит для генетических манипуляций и в естественных условиях визуализации, что делает его все более популярной моделью для обратного генетических исследований и для генерации transgenics для в естественных условиях визуализации. Эти уникальные возможности делают рыбу данио идеальной платформой для изучения развития и физиологии глазной линзы. Наши недавние выводы о том, что Аквапорин-0, Aqp0a, необходим для устойчивости шва переднего объектива, а также для смещения ядра объектива к центру объектива с возрастом привели нас к разработке инструментов, особенно подходящих для анализа свойств рыб-рыбок данио. Здесь мы очертить подробные методы рассечения объектива, которые могут быть применены как для личинок и взрослых линз, чтобы подготовить их для гистологического анализа, иммуногистохимии и визуализации. Мы фокусируемся на анализе целостности линз шва и морфологии клеток корковых и сравнить данные, полученные от расчлененных линз с данными, полученными в естественных условиях визуализации морфологии объектива стало возможным благодаря новой трансгенной рыбы-данио линии с генетически закодированный флуоресцентный маркер. Анализ расчлененных линз, перпендикулярных их оптической оси, позволяет количественно определять относительное положение ядра объектива вдоль передней-задней оси. Движение ядра объектива от начального переднего положения к центру необходимо для нормальной оптики объектива у взрослых рыб данио. Таким образом, количественная мера ядерной позиции объектива напрямую коррелирует с его оптическими свойствами.
Introduction
Рыба данио является отличной моделью для изучения развития и физиологии объектива из-за анатомического сходства с объективами млекопитающих, относительной легкости генетических и фармакологических манипуляций, скорости эмбрионального развития глаз, небольшого размера и прозрачности на ранних стадиях, позволяющий в естественных условиях визуализации. Методы, описанные здесь были разработаны для анализа морфологии рерио рыбы объектива в эмбриональных и взрослых этапах с акцентом на культурной целостности, корковых мембранных морфологии в пробирке и в естественныхусловиях, и местоположение объектива ядерной позиции вдоль передней задней оси ex естественныхусловиях. Эти методы служат отправной точкой для функциональных исследований развития и физиологии линз, а также обратных генетических экранов для фенотипов объектива в рыбе данио.
Морфология рыб изображения данио зебрая
Аквапорин 0 (AQP0) является наиболее распространенным белком мембранный объектив и имеет решающее значение для обоих, объектив развития и ясности, из-за нескольких основных функций у млекопитающих. У рыбы данио есть два Aqp0s (Aqp0a и Aqp0b), и мы разработали методы анализа потери их функций как в эмбриональных, так и взрослых объективах. Наши исследования показывают, чтоaqp0a-/-мутанты развивают переднюю полярную непрозрачность из-за нестабильности переднего шва, и aqp0a/b Двойные мутанты развивают ядерную непрозрачность1. AQP0 было показано, играть роли в водный транспорт2, адгезия3,4, цитоскелетная якорь5 и генерация градиента индекса преломления6, но эти исследования в значительной степени были выполнены в пробирке. Рыба данио дает уникальную возможность изучить, как потеря функции, или Возмущенные функции Aqp0a или Aqp0b повлияет на морфологию и функции в живых линз. Для оценки морфологии клеток объектива и культурной целостности во время разработки, мы модифицировали существующие в пробирке иммуногистхимических методов7 для использования в эмбриональных и взрослых линз, и генерируемые трансгенов, чтобы контролировать этот процесс в естественных условиях .
Иммуногистизухимический анализ структуры мембраны плазмы и культурной целостности был выполнен в цельных фиксированных эмбрионах и взрослых объективах. Линзы зебрая рыбы чрезвычайно малы (диаметр объектива ~ 100 мкм в зародыши и до 1 мм у взрослых) по сравнению со своими коллегами млекопитающих и имеют точешвы8, которые редко улавливаются в криометазах. Таким образом, целые линзы необходимы для анализа культурной целостности. Для в естественных условиях анализ формирования переднего шва, и визуализации точной архитектуры клеток объектива, мы генерируются transgenics выражая Mapple конкретно маркировки линз мембраны.
Преимущества живой визуализации transgenics мембраны объектива включают в себя: 1) избежать фиксации артефактов, 2) изучение динамических морфологических изменений в покадровой фильмов, и 3) позволяет продольных исследований, в которых ранее события могут быть коррелированы с более поздней Фенотипов. Пигментация радужки обычно предотвращает четкое изображение периферии объектива. Добавление 1-фенил 2-тиуреа (PTU) до Примордия-5 (прим-5) стадия9 предотвращает Меланогенез и пигментацию глаз до примерно 4 дней постоплодотворения (DPF). Однако, после 4 DPF, периферия объектива скрыта в естественныхусловиях, особенно на старших стадиях. Кроме того, плотность объектива сама затемняет изображения его заднего полюса. Поэтому, чтобы изучить морфологию периферии объектива, или задний шов, после 4 DPF, линзы должны быть иссечено и исправлено.
Трансгенные линии рыбы данио были использованы для анализа эмбриональных мембранные структуры объектива в естественныхусловиях10. Q01 трансгенных выражает голубого флуоресцентного белка сливается с мембраны таргетинга последовательности, Gap43, движимый EF1α промоутер и гексамера DF4 PAX6 усилитель элемента повсеместно в линзы волокна клетки11. Q01 имеет экстра-линзовидные выражения, в том числе амакрин клеток в сетчатке, которая добавляет фоновый сигнал, если основной интерес является объектив. Мы разработали новую трансгенную линию, которая выражает мембранно-привязку mApple специально в объективе, с целью избежать любого экстра-линзовидные сигнала.
Локализация ядра объектива
Мы обнаружили, что ядро объектива перемещается из первоначального переднего расположения в личиночной данио, к центральному расположению в передней-задней оси во взрослых линз. Этот сдвиг в положении ядра объектива преломления индекса, как полагают, является требованием для нормального развития рыбы-объектива зебрано-оптики1. Наши методы позволяют количественно определять ядерную централизацию объектива по отношению к радиусу объектива. Используя этот метод, мы показали, что Aqp0a требуется для объектива ядерная централизация1, и этот простой метод может быть применен к другим исследованиям развития и физиологии объектива и его оптических свойств в модели рыбы данио.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ морфологии линзы данио рерио является начальным шагом в понимании фенотипов в мутантах, или эффекты фармакологических вмешательств, направленных на изучение биологии глазной линзы. Мы обрисовать методы для анализа швов объектива, корковых морфологии клеток волокна и аспекты о…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить наш источник финансирования: низ R01 EY05661 к J. E. H, Инес Герринг для оказания помощи в генерации aqp0a/b двойных мутантов и рерио рыбоводства, д-р Даниэль Дранов для дискуссий, ведущих к генерации transgenics, д-р Брюс Лаборатории Блумберга и доктора Кена Чо для использования их анатомический микроскопов, и д-р Меган Смит за помощью в статистическом анализе.
Materials
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | CAUTION – very toxic |
| 4% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 157-4 | CAUTION – health hazard, combustible |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | Objective and chamber temperature set to -21˚C |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | CAUTION – irritating to eyes and skin |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128 | CAUTION – combustible, penetrates skin |
| Disposable base mold | VWR Scientific | 15154-631 | |
| Disposable Pasteur glass pipets | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Dumont # 5 forceps | Dumont & Fils | Keep forceps sharpened | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | CAUTION – toxic |
| Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct | Addgene | ID:122451 | |
| ImageJ | Wayne Rasband, NIH | v1.51n | |
| Low Melt Agarose (LMA) | Apex | 902-36-6 | |
| NIS-Elements | Nikon | V 4.5 | |
| NIS-Elements AR software | Nikon | ||
| Olympus with a model 2.1.1.183 controller | Olympus Corp | DP70 | |
| Olympus microscope | Olympus Corp | SZX12 | |
| Phalloidin-Alexa Flour 546 | Thermo Fisher | A22283 | |
| Phenol Red indicator (1% w/v) | Ricca Chemical Company | 5725-16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399 | |
| Photoshop | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Photoshop software | Adobe | CS5 v12.0 | |
| Plan Apo 60x/1.2 WD objective | Nikon | ||
| Power source | Wild Heerbrugg | MTr 22 | Or equivalent power source |
| Slide warmer model No. 26020FS | Fisher Scientific | 12-594 | |
| Sodium Hydroxide beads | Fisher Scientific | S612-3 | CAUTION – corrosive/irritating to eyes and skin, target organ – respiratory system, corrosive to metals |
| Superfrost/Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Sylgard 184 silicone Dow Corning | World Prevision Instruments | SYLG184 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Triton X-100 BioXtra | Sigma | T9284 | CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive |
| Vannas micro-dissection scissors | Ted Pella Inc | 1346 | Sharp/sharp straight tips |
| Vectashield antifade mouting medium | Vector laboratories | H-1000 | |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594 | Life Technologies | W11262 |
References
- Vorontsova, I., Gehring, I., Hall, J. E., Schilling, T. F. Aqp0a Regulates Suture Stability in the Zebrafish Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (7), 2869-2879 (2018).
- Hall, J. E., Mathias, R. T. The Aquaporin Zero Puzzle. Biophysical Journal. 107 (1), 10-15 (2014).
- Nakazawa, Y., Oka, M., Funakoshi-Tago, M., Tamura, H., Takehana, M. The Extracellular C-loop Domain Plays an Important Role in the Cell Adhesion Function of Aquaporin 0. Current Eye Research. 42 (4), 617-624 (2017).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Intact AQP0 performs cell-to-cell adhesion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (3), 1034-1039 (2009).
- Lindsey Rose, K. M., et al. The C Terminus of Lens Aquaporin 0 Interacts with the Cytoskeletal Proteins Filensin and CP49. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (4), 1562-1570 (2006).
- Kumari, S. S., Varadaraj, K. Aquaporin 0 plays a pivotal role in refractive index gradient development in mammalian eye lens to prevent spherical aberration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 452 (4), 986-991 (2014).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on Cryosections from Embryonic and Adult Zebrafish Eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (7), (2007).
- Dahm, R., Schonthaler, H. B., Soehn, A. S., van Marle, J., Vrensen, G. F. J. M. Development and adult morphology of the eye lens in the zebrafish. Experimental Eye Research. 85 (1), 74-89 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. Early lens development in the zebrafish: A three-dimensional time-lapse analysis. Developmental Dynamics. 238 (9), 2254-2265 (2009).
- Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2002).
- Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. 261, 59-94 (2002).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Hou, H. H., Kuo, M. Y. P., Luo, Y. W., Chang, B. E. Recapitulation of human βB1-crystallin promoter activity in transgenic zebrafish. Developmental Dynamics. 235 (2), 435-443 (2006).
- Soules, K., Link, B. Morphogenesis of the anterior segment in the zebrafish eye. BMC Developmental Biology. 5 (1), 12 (2005).
- Greiling, T. M. S., Clark, J. I. The transparent lens and cornea in the mouse and zebra fish eye. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (2), 94-99 (2008).
- Greiling, T. M. S., Aose, M., Clark, J. I. Cell Fate and Differentiation of the Developing Ocular Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1540-1546 (2010).
- Richardson, R., Tracey-White, D., Webster, A., Moosajee, M. The zebrafish eye-a paradigm for investigating human ocular genetics. Eye. 31, 68 (2016).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. F. The Visual System of Zebrafish and its Use to Model Human Ocular Diseases. Developmental Neurobiology. 72 (3), 302-327 (2012).
- Chhetri, J., Jacobson, G., Gueven, N. Zebrafish on the move towards ophthalmological research. Eye. 28 (4), 367-380 (2014).
- Lim, J. C., Walker, K. L., Sherwin, T., Schey, K. L., Donaldson, P. J. Confocal Microscopy Reveals Zones of Membrane Remodeling in the Outer Cortex of the Human Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (9), 4304-4310 (2009).
- Lim, J. C., Vaghefi, E., Li, B., Nye-Wood, M. G., Donaldson, P. J. Characterization of the Effects of Hyperbaric Oxygen on the Biochemical and Optical Properties of the Bovine LensEffects of HBO on the Bovine Lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (4), 1961-1973 (2016).
- Gold, M. G., et al. AKAP2 anchors PKA with aquaporin-0 to support ocular lens transparency. EMBO Molecular Medicine. 4 (1), 15-26 (2012).
- Petrova, R. S., Schey, K. L., Donaldson, P. J., Grey, A. C. Spatial distributions of AQP5 and AQP0 in embryonic and postnatal mouse lens development. Experimental Eye Research. 132, 124-135 (2015).
- Chee, K. N., Vorontsova, I., Lim, J. C., Kistler, J., Donaldson, P. J. Expression of the sodium potassium chloride cotransporter (NKCC1) and sodium chloride cotransporter (NCC) and their effects on rat lens transparency. Molecular Vision. 16, 800-812 (2010).
- Hayes, J. M., et al. Integrin α5/fibronectin1 and focal adhesion kinase are required for lens fiber morphogenesis in zebrafish. Molecular Biology of the Cell. 23 (24), 4725-4738 (2012).
- Imai, F., Yoshizawa, A., Fujimori-Tonou, N., Kawakami, K., Masai, I. The ubiquitin proteasome system is required for cell proliferation of the lens epithelium and for differentiation of lens fiber cells in zebrafish. Development. 137 (19), 3257-3268 (2010).
- Biswas, S. K., Lee, J. E., Brako, L., Jiang, J. X., Lo, W. K. Gap junctions are selectively associated with interlocking ball-and-sockets but not protrusions in the lens. Molecular Vision. 16, 2328-2341 (2010).
