Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Summary

Nous décrivons ici l’ex vivo expansion des cellules souches hématopoïétiques CD34⁺ cellules provenant du sang de cordon ombilical traitement avec une combinaison d’un cocktail de cytokine et l’APV. Cette méthode conduit à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif des deux cliniques ou les applications de laboratoire.

Abstract

Unités de sang (UCB) cordon ombilical offrent une autre source de cellules souches hématopoïétiques humaines (CSH) pour les patients qui ont besoin de transplantation allogénique de moelle osseuse. Alors que l’UCB a plusieurs avantages uniques, le nombre limité de GPX au sein de chaque unité UCB limite leur utilisation en médecine régénératrice et greffe de csh chez l’adulte. Expansion efficace de csh humaine fonctionnelle peut être réalisée par ex vivo cultivant des CD34⁺ des cellules isolées d’UCB et traités avec un inhibiteur de la désacétylase, acide valproïque (VPA). Le protocole détaillé ici décrit les conditions de culture et de la méthodologie d’isoler rapidement CD34⁺ des cellules et l’étendre à un haut degré un pool de csh primitif. Le csh élargi est capables d’établir la prise de greffe à court et à long terme et peuvent donner lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques différenciées. Cette méthode aussi détient potentielle d’application clinique dans la thérapie génique csh autologue et fournit une approche intéressante pour surmonter la perte de csh fonctionnelle associée à la modification des gènes.

Introduction

Expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de sang de cordon ombilical unités (UCB) est très prometteur pour les applications de HSC en médecine régénératrice et de thérapie de la transplantation. Transplantation avec des unités de l’UCB a plusieurs avantages uniques telles que la collecte facile, haute disponibilité, un risque minime d’infection, le faible risque de rechute de la maladie et de basse fréquence de graft-versus maladie l’hôte (GVH). Toutefois, les principaux inconvénients de leur utilisation dans des milieux cliniques sont du nombre limité de csh présents au sein de chaque unité UCB¹. Le nombre insuffisant de csh provoque retard prise de greffe et reprise hématopoïétique, risque de rejet du greffon et de reconstitution immunitaire aberrante.

Actuellement, les différentes méthodes et stratégies ont été développés pour ex vivo, élargir le nombre limité de csh de l’UCB. Combinaisons de différentes cytokines cocktails avec petites molécules ou des composés en ex vivo résultat de cultures à des degrés divers de l’expansion du HSC numéros^{2,3,4,5,6, 7,8}. Ce qui est important, ex vivo culture conditions induisent stress, menant à la prolifération cellulaire rapide, une activité métabolique accrue et la perte des caractéristiques primitives qui définissent les CSH primaire. Par conséquent, les protocoles en développement qui conduisent à l’expansion d’un grand nombre de csh fonctionnelle avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement aux primaires autorenouveler primitif sont nécessaires.

Des cultures sans sérum de CD34⁺ cellules isolées d’UCB et traités avec le résultat de (APV) acide valproïque dans l’expansion d’un grand nombre de primitives autorenouveler^4,9,10. L’expansion de HSC n’est pas uniquement due à la prolifération de la csh existantes dérivées de l’UCB. Au lieu de cela, cette expansion est attribuable à l’acquisition d’un phénotype primitif associé à un nombre limité de divisions cellulaires et prolifération⁹. Dans le première 24 à 48 h d’incubation avec une combinaison de cytokines et VPA, CD34⁺ cellules acquièrent une transcriptomique et profil phénotypique qui caractérisent les CSH à long terme. L’augmentation significative du pourcentage de csh est accompagnée d’une augmentation rapide du nombre de csh (augmentation de 63 fois dans les 24 h de traitement de l’APV)⁹. Notamment, la stratégie d’expansion APV-ex vivo s’étend des CSH avec faible activité métabolique, ce qui souligne encore leurs caractères primitifs.

La méthode décrite ici fournit des affections et les traitements qui conduisent à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif pour soit clinique ou les applications de laboratoire. Cette ex vivo stratégie d’expansion utilise un cocktail de cytokine, combiné avec le traitement de l’APV. VPA est un médicament approuvé par la FDA pour le traitement des troubles bipolaires et autres maladies neurologiques. L’expansion de HSC avec APV est rapide et se produit dans les 7 jours, réduisant au minimum la durée de la manipulation et le risque de contamination. Ce qui est important, ce protocole permet l’acquisition de longue durées marqueurs phénotypiques HSC comme CD90 et CD49f sous 24-48 h après traitement avec APV⁹. Greffes de csh élargis créés avec ce protocole ont la capacité de régénérer le système hématopoïétique, car elles peuvent se différencier en toutes les lignées de cellules hématopoïétiques et établir la greffe à long terme suite à une transplantation chez la souris myeloablated NSG les modèles⁴. De plus, ce protocole est hautement reproductible et permet une isolation efficace et rapide de CD34 viable⁺ les cellules de l’UCB, ce qui est essentiel pour l’industrialisation de cette procédure.

L’APV ex vivo protocole d’expansion a également le potentiel pour surmonter la perte importante de csh, qui se produit pendant le gène édition¹¹. Gène montage exige une exposition aux cytokines, qui sont nécessaires pour les cellules cyclisme et l’activation des mécanismes de réparation de l’ADN. En raison des effets rapides de traitement de l’APV, cette méthode peut être bénéfique pour la génération d’un nombre plus élevé de cellules génétiquement modifiées dans un délai qui est pertinente pour actuellement utilisé des protocoles de modification génétique.

Protocol

Le HSC ex vivo protocole d’expansion suit les directives de la Commission d’éthique de recherche au Mount Sinai School of Medicine. 1. tampon et la préparation des médias Préparer le tampon de séparation 24 h avant l’isolement du CD34+ cellules de canettes usagées en ajoutant 2 mL de 0,5 M éthylène Diamine tétra-acétique (EDTA) et 33 mL de 7,5 % albumine sérique Bovine (BSA) à 465 mL tamponné physiologique (solution de 1 PBS x). Mélanger doucement et ma…

Representative Results

L’ex vivo protocole décrit ici augmente le nombre de primitives GPX générés par CD34+ cellules isolées de l’UCB (Figure 1). Amorçage du CD34+ cellules pendant 16 h avec une cytokine cocktail, suivi du traitement par APV supplémentaires 7 jours, conduit à une grande expansion de HSC. Fait remarquable, le pool de cellules élargis est hautement enrichi pour csh, qui est phénotypiquement défini par CD34+CD90+</…

Discussion

Ici, nous présentons un protocole visant à développer rapidement de manière significative le nombre de csh humaine fonctionnelle de l’UCB. Les études pilotes et cinétiques utilisant ce protocole indiquent que l’ex vivo cellules élargies rapidement acquérir et conserver l’expression de plusieurs marqueurs phénotypiques HSC CD90 ainsi que primitive HSC caractéristiques métaboliques⁹.

Ex vivo protocole d’expansion est relativement simple et fiable. Purif…

Materials

Expansion Media	Sigma-Aldrich	Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells.	Nexcelom	CS2-0106-25mL
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581	BD BIOSCIENCE	555824
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21	BD BIOSCIENCE	555751
autoMACS Rinsing Solution	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
BD Falcon 15 ml Tube	BD Biosciences	352097
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	BD Biosciences	352063
BD Falcon 50 ml Tube	BD Biosciences	352098
Bovine serum albumine solution	Sigma-Aldrich	A8412
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human	Miltenyi Biotec	130-046-703
Cell analyzer	BD Biosciences	FACS Canto II
Cell analyzer and sorter	BD Biosciences	FACS Aria II
Cell counter	Nexcelom	Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter
Cell separator device	autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec
Counting Chambers	Nexcelom	CHT4-PD100-002
Density gradient media	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E8008-100ML
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10	BIOLEGEND	328108
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody	BIOLEGEND	400109
Inverted microscope
PBS	Corning cellgro	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein	R&D Systems	308FKN
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3)	R&D Systems	203-IL
Recombinant Human SCF Protein	R&D Systems	255-SC
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO)	R&D Systems	288-TP
Total Antibody Compensation Bead Kit	thermofisher	A10497
Umbilical Cord-blood	Placental Blood Program at the New York Blood Center	http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/
Valproic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	P4543