पूर्व Vivo मानव गर्भनाल रक्त से टेम स्टेम कोशिकाओं के विस्तार-व्युत्पंन CD34+ कोशिकाओं Valproic एसिड का उपयोग
Summary
यहां, हम CD34 के पूर्व वीवो विस्तार का वर्णन है+ कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं गर्भनाल रक्त से व्युत्पंन एक cytokine कॉकटेल और vpa के संयोजन के साथ इलाज किया । इस विधि या तो नैदानिक या प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए आदिम HSCs के पूर्व vivo विस्तार की एक महत्वपूर्ण डिग्री की ओर जाता है ।
Abstract
गर्भनाल रक्त (UCB) इकाइयों रोगियों जो allogeneic अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण की आवश्यकता के लिए मानव टेम स्टेम सेल (HSCs) का एक वैकल्पिक स्रोत प्रदान करते हैं । जबकि UCB के कई अनूठे फायदे हैं, प्रत्येक UCB इकाई के भीतर HSCs की सीमित संख्या में पुनर्योजी चिकित्सा और वयस्कों में HSCS प्रत्यारोपण में उनके उपयोग की सीमा है । कार्यात्मक मानव hscs के कुशल विस्तार CD34+ ucbs से अलग कोशिकाओं और एक deacetylase अवरोध करनेवाला, वैल्पोरिक एसिड (vpa) के साथ इलाज के पूर्व vivo संवर्धन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । यहां विस्तृत प्रोटोकॉल संस्कृति की स्थिति और पद्धति को तेजी से CD34+ कोशिकाओं को अलग और एक उच्च डिग्री आदिम hscs के एक पूल के लिए विस्तार का वर्णन करता है । विस्तारित एचएससी दोनों अल्पकालिक और दीर्घकालिक एंगर्फटमेंट स्थापित करने में सक्षम हैं और सभी प्रकार के विभेदित टेम कोशिकाओं को जन्म देने में सक्षम हैं । इस पद्धति में भी नैदानिक आवेदन के लिए क्षमता ऑटोलॉगस hsc जीन थेरेपी रखती है और एक आकर्षक दृष्टिकोण प्रदान करता है जीन संपादन के साथ जुड़े कार्यात्मक hsc की हानि को दूर करने के लिए ।
Introduction
पूर्व विवो गर्भनाल रक्त (ucb) इकाइयों से टेम स्टेम सेल (hscs) के विस्तार पुनर्योजी चिकित्सा और प्रत्यारोपण थेरेपी में hscs अनुप्रयोगों के लिए महान वादा रखती है । यूसीबी इकाइयों के साथ प्रत्यारोपण ऐसे आसान संग्रह, उच्च उपलब्धता, संक्रमण का ंयूनतम जोखिम, रोग पतन के कम जोखिम, और graft बनाम मेजबान रोग (GVHD) की कम आवृत्ति के रूप में कई अनूठे लाभ है । तथापि, नैदानिक विन्यास में उनके उपयोग के प्रमुख नुकसान प्रत्येक यूसीबी यूनिट1के भीतर मौजूद एचएससी की सीमित संख्या हैं । Hscs की अपर्याप्त संख्या में देरी engraftment और टेम रिकवरी, भ्रष्टाचार अस्वीकृति के जोखिम, और ंयायपालिका प्रतिरक्षा पुनर्गठन में परिणाम है ।
वर्तमान में, पूर्व वीवो के लिए विभिंन तरीकों और रणनीतियों को विकसित किया गया है UCBs से HSCs की सीमित संख्या का विस्तार । छोटे अणुओं या यौगिकों में पूर्व vivo संस्कृतियों के साथ विभिन्न cytokine कॉकटेल के संयोजन hsc संख्या2,3,4,5,6में विस्तार के विभिन्न डिग्री में परिणाम, 7,8. महत्वपूर्ण बात, पूर्व vivo संस्कृति की स्थिति तनाव प्रेरित, तेजी से सेल प्रसार के लिए अग्रणी, चयापचय गतिविधि और आदिम विशेषताओं है कि प्राथमिक HSCs परिभाषित की हानि वृद्धि हुई है । इसलिए, ऐसे प्रोटोकॉलों का विकास करना जो प्राथमिक आदिम जनजातियों के निकट समान विशेषताओं वाले कार्यात्मक एचएससी की बड़ी संख्या का विस्तार करने की आवश्यकता है ।
सीरम मुक्त CD34 की संस्कृतियों+ ucbs से अलग कोशिकाओं और वैल्पोरिक एसिड के साथ इलाज (vpa) आदिम hscs की बड़ी संख्या के विस्तार में परिणाम4,9,10. शहरी सहकारी बैंकों से प्राप्त मौजूदा एचएससी के प्रसार के कारण ही HSC का विस्तार नहीं हो पा रहा है । इसके बजाय, यह विस्तार एक आदिम phenotype के अधिग्रहण के कारण सेल डिवीजनों और प्रसार9की एक सीमित संख्या के साथ संयुक्त है। प्रारंभिक 24 के भीतर-साइटोकिंस और vpa का एक संयोजन के साथ ऊष्मायन के एच, CD34+ कोशिकाओं को एक transcriptomic और लक्षणप्ररूपी प्रोफ़ाइल है कि लंबे समय तक hscs की विशेषता प्राप्त. एचसीएस के प्रतिशत में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ एचसीएस की संख्या में तत्काल वृद्धि (वीपीए उपचार के 24 एच के भीतर ६३ गुना वृद्धि) के साथ है । विशेष रूप से, VPA-पूर्व vivo विस्तार रणनीति कम चयापचय गतिविधि है, जो आगे उनके आदिम विशेषताओं पर प्रकाश डाला गया के साथ HSCs फैलता है ।
यहां वर्णित विधि शर्तों और उपचार है कि या तो नैदानिक या प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए पूर्व vivo विस्तार के एक महत्वपूर्ण डिग्री के लिए नेतृत्व प्रदान करता है । यह पूर्व vivo विस्तार रणनीति एक cytokine कॉकटेल VPA उपचार के साथ संयुक्त का उपयोग करता है । VPA द्विध्रुवी विकारों और अंय स्नायविक रोगों के उपचार के लिए एक एफडीए को मंजूरी दे दी दवा है । VPA के साथ HSC विस्तार शीघ्र और 7 दिनों के भीतर होता है, हेरफेर के दोनों समय और संदूषण के जोखिम को कम करने । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है दीर्घकालिक hsc लक्षणप्ररूपी मार्करों जैसे CD90 और CD49f के भीतर 24-48 एच vpa के साथ उपचार के बाद9। विस्तारित hsc इस प्रोटोकॉल के साथ बनाया grafts के बाद से वे सभी टेम कोशिका वंश में अंतर कर सकते है और myeloablated एनएसजी चूहों में प्रत्यारोपण के बाद लंबी अवधि के engraftment स्थापित करने के लिए टेम प्रणाली पुनर्जीवित करने की क्षमता है मॉडल4। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अत्यधिक reproducible है और व्यवहार्य CD34+ ucbs, जो इस प्रक्रिया के औद्योगिकीकरण के लिए महत्वपूर्ण है से कोशिकाओं के कुशल और तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है ।
VPA ex vivo विस्तार प्रोटोकॉल भी HSCs के महत्वपूर्ण नुकसान जो जीन संपादन11के दौरान होता है पर काबू पाने की क्षमता है । जीन संपादन cytokines, जो साइकिल चालन कोशिकाओं और डीएनए की मरंमत तंत्र के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है के लिए जोखिम की आवश्यकता है । VPA उपचार के तुरंत प्रभाव के कारण, इस विधि के समय की अवधि है कि वर्तमान में उपयोग जीन संशोधन प्रोटोकॉल के लिए प्रासंगिक है के भीतर आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं की एक उच्च संख्या के उत्पादन के लिए फायदेमंद हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके साथ ही, हम यूसीबी से कार्यात्मक मानव एचएससी की संख्या में तेजी से विस्तार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर पायलट और काइनेटिक अध्ययनों से संकेत मिलता है कि पूर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के लिए NYSTEM अनुदान C030136 द्वारा समर्थित किया गया था आरएचताहिलियानी हम उनकी प्रतिक्रिया और पांडुलिपि के संशोधन के लिए Bartek Jablonski शुक्रिया अदा करना चाहूंगा
Materials
| Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
| AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
| APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
| Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
| Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
| Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
| FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
| Inverted microscope | |||
| PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
| Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
| Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
| Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
| Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |
References
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