Her beskriver vi ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra CD34+ cellene stammer fra navlestrengsblod behandlet med en kombinasjon av cytokin cocktail og VPA. Denne metoden fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer.
Navlestreng blod (UCB) enheter gir en alternativ kilde for menneskelig blodkreft stamceller (HSCs) for pasienter som trenger allogene benmarg transplantasjon. Mens UCB har flere unike fordeler, begrenser begrenset antall HSCs innenfor hver UCB enhet deres bruk i regenerativ medisin og HSC transplantasjon hos voksne. Effektiv utvidelse av funksjonell menneskelige HSCs oppnås ved ex vivo dyrking av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandles med en deacetylase hemmer, valproic acid (VPA). Protokollen detaljert her beskriver oppdrettsforholdene og metodikk raskt isolere CD34+ celler og utvide til en høy grad en pool av primitive HSCs. De utvidede HSCs er i stand til å etablere både kortsiktige og langsiktige engraftment og kan gi opphav til alle typer differensiert blodkreft cellene. Denne metoden også har potensial for klinisk anvendelse i autologous HSC genterapi og gir en attraktiv tilnærming for å overvinne tap av funksjonelle HSCs forbundet med gene redigering.
Ex vivo utvidelse av blodkreft stamceller (HSCs) fra navlestrengsblod (UCB) enheter har store løftet for HSC programmer i regenerativ medisin og transplantasjon behandling. Transplantasjon med UCB enheter har flere unike fordeler som lett samling, høy tilgjengelighet, minimal risiko for infeksjon, lav risiko for sykdom tilbakefall, og lav frekvens av graft versus host sykdom (GVHD). Større ulempene av deres bruk i klinisk er imidlertid begrenset antall HSCs stede i hver UCB enhet1. Utilstrekkelig antall HSCs resulterer i forsinket engraftment og blodkreft utvinning, risiko for pode avvisning og avvikende immune rekonstituering.
Foreløpig har ulike metoder og strategier blitt utviklet for å ex vivo utvide begrenset antall HSCs fra UCBs. Kombinasjoner av ulike cytokin cocktailer med små molekyler eller forbindelser i ex vivo kulturer føre til ulike grader av ekspansjon i HSC tall2,3,4,5,6, 7,8. Viktigere, ex vivo kultur indusere vilkår stress, fører til rask celle spredning, økt metabolsk aktivitet og tap av arter som definerer primære HSCs. Derfor er utvikle protokoller som fører til utvidelse av et stort antall funksjonelle HSCs med egenskaper som ligner primære primitive HSCs nødvendig.
Serum-free kulturer av CD34+ celler isolert fra UCBs og behandlet med valproic acid (VPA) resultere i utvidelsen av store antall primitive HSCs4,9,10. HSC utvidelsen er ikke utelukkende på grunn av spredning av de eksisterende HSCs avledet fra UCBs. I stedet skyldes denne utvidelsen kjøpet av en primitiv fenotypen kombinert med et begrenset antall celledelinger og spredning9. Innen de første 24-48 timer med inkubering med en kombinasjon av cytokiner og VPA, CD34+ cellene erverver en transcriptomic og fenotypiske profil som karakteriserer langsiktige HSCs. Den betydelige økningen i andelen HSCs er ledsaget av en rask økning i antall HSCs (63 fold økning innen 24 timer av VPA behandling)9. Spesielt utvider VPA-ex vivo ekspansjonsstrategi HSCs med lav metabolsk aktivitet, som ytterligere understreker deres arter.
Metoden beskrevet her gir forhold og behandlinger som fører til en betydelig grad av ex vivo utvidelse av primitive HSCs for klinisk eller laboratorium programmer. Denne ex vivo ekspansjonsstrategi bruker en cytokin cocktail kombinert med VPA behandling. VPA er en FDA godkjent narkotika for behandling av bipolar lidelser og andre nevrologiske sykdommer. HSC utvidelse med VPA er rask og oppstår innen 7 dager, minimere både av manipulasjon og fare for angrep. Viktigere, lar denne protokollen for kjøp av langsiktige HSC fenotypiske markører som CD90 og CD49f innen 24-48 timer etter behandling med VPA9. Utvidet HSC grafts opprettet med denne protokollen har kapasitet til å regenerere blodkreft systemet siden de kan skille ut alle blodkreft celle overleveringslinjer og etablere langsiktig engraftment etter transplantasjon i myeloablated NSG mus modeller4. Dessuten, denne protokollen er svært reproduserbar og gir effektiv og rask isolering av levedyktig CD34+ celler fra UCBs, som er avgjørende for industrialisering av denne prosedyren.
VPA ex vivo ekspansjon protokollen har potensial til å overvinne betydelige tap av HSCs som oppstår under genet redigering11. Gene redigering krever eksponering for cytokiner, som er nødvendig for sykling celler og aktivering av DNA-reparasjon mekanismer. På grunn av rask effekten av VPA behandling, kan denne metoden være gunstig for generering av et større antall genmodifiserte celler innenfor en periode som er relevante for utnyttet genet modifikasjon protokoller.
Her presenterer vi en protokoll for å raskt utvide betydelig antall funksjonell menneskelige HSCs fra UCBs. Pilot og kinetisk studier bruker denne protokollen indikerer at den ex vivo utvidet cellene raskt skaffe og beholde uttrykk for flere HSC fenotypiske indikatorer inkludert CD90 samt primitive HSC metabolske egenskaper9.
Dette ex vivo ekspansjon protokollen er relativt enkel og pålitelig. Rensing av CD34+ celler med cellen skilletegn enheten (se <stron…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NYSTEM gi C030136 til R.H. Vi vil gjerne takke Bartek Jablonski for hans tilbakemeldinger og revisjon av manuskriptet
Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
Inverted microscope | |||
PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |