Aqui, descrevemos o ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas do CD34+ células derivadas do sangue do cordão umbilical, tratados com uma combinação de um cocktail de citocinas e VPA. Esse método leva a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório.
Unidades de sangue (UCB) do cordão umbilical fornecem uma fonte alternativa de células-tronco hematopoiéticas humanas (linfócitos) para pacientes que necessitam de transplante de medula óssea alogênico. Enquanto UCB tem várias vantagens exclusivas, o número limitado de linfócitos dentro de cada unidade da UCB limita seu uso na medicina regenerativa e HSC transplante em adultos. Expansão eficiente de linfócitos humanos funcionais pode ser alcançado por ex vivo cultivo de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com um inibidor da deacetilase, ácido valproico (VPA). O protocolo detalhado aqui descreve as condições de cultura e metodologia para isolar rapidamente CD34+ células e expandir para um alto grau, uma piscina de linfócitos primitivos. Os linfócitos expandidos são capazes de estabelecer a enxertia de curto e longo prazo e são capazes de dar origem a todos os tipos de células hematopoiéticas diferenciadas. Esse método também possui potencial para aplicação clínica em terapia de gene autóloga HSC e fornece uma abordagem atraente para superar a perda de linfócitos funcionais associados com a edição de gene.
Ex vivo expansão de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) do sangue do cordão umbilical unidades (UCB) é uma grande promessa para aplicações de HSC na terapia de transplante e medicina regenerativa. Transplante com unidades UCB tem várias vantagens exclusivas, tais como a coleção fácil, alta disponibilidade, risco mínimo de infecção, baixo risco de recaída da doença e de baixa frequência da doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD). No entanto, as principais desvantagens da sua utilização em ambientes clínicos são o número limitado de linfócitos presentes dentro de cada UCB unidade1. O número insuficiente de linfócitos resulta em atrasada enxertia e recuperação hematopoiética, risco de rejeição do enxerto e reconstituição imune aberrante.
Atualmente, vários métodos e estratégias foram desenvolvidas para ex vivo expandir o número limitado de linfócitos de UCBs. Combinações de diferentes citocinas cocktails com pequenas moléculas ou compostos em ex vivo resultado de culturas em vários graus de expansão em HSC números2,3,4,5,6, 7,8. Importante, ex vivo cultura condições induzem estresse, levando à proliferação celular rápida, aumento da atividade metabólico e perda das características primitivas que definem linfócitos primários. Portanto, protocolos em desenvolvimento que levam à expansão de um grande número de linfócitos funcionais com características que se assemelham a primários linfócitos primitivos são necessários.
Culturas de soro livre de CD34+ células isoladas de UCBs e tratados com resultado de (VPA) ácido valproico na expansão de um grande número de linfócitos primitivos4,9,10. A expansão de HSC não é unicamente devido à proliferação dos linfócitos existentes derivado UCBs. Em vez disso, esta expansão é devido à aquisição de um fenótipo primitivo, combinado com um número limitado de divisões celulares e proliferação9. Dentro o inicial 24 – 48 h de incubação com uma combinação de citocinas e VPA, CD34+ células adquirem um perfil fenotípico que caracterizam a longo prazo linfócitos e transcriptomic. O aumento significativo da percentagem de linfócitos é acompanhado por um aumento rápido do número de linfócitos (aumento de 63 vezes dentro de 24 h de tratamento VPA)9. Nomeadamente, a estratégia de expansão do VPA-ex vivo expande linfócitos com baixa atividade metabólica, que destaca ainda mais suas características primitivas.
O método descrito aqui fornece condições e tratamentos que levam a um grau significativo de ex vivo expansão dos linfócitos primitivos para qualquer clínica ou aplicações de laboratório. Ex vivo de estratégia de expansão usa um cocktail de citocina combinado com tratamento de VPA. VPA é um medicamento aprovado pela FDA para o tratamento de transtorno bipolar e outras doenças neurológicas. A expansão de HSC com VPA é rápida e ocorre dentro de 7 dias, minimizando o tempo de manipulação e o risco de contaminação. Importante, este protocolo permite a aquisição de longo prazo marcadores fenotípicos de HSC como CD90 e CD49f dentro de 24-48 h após o tratamento com VPA9. Enxertos HSC expandidos criados com este protocolo têm a capacidade de regenerar o sistema hematopoiético, uma vez que podem se diferenciar em todas as linhagens de células hematopoiéticas e estabelecer a longo prazo enxertia após transplante em ratos NSG myeloablated modelos4. Além disso, este protocolo é altamente reprodutível e permite a rápida e eficiente de isolamento de CD34 viável+ células de UCBs, que é fundamental para a industrialização deste procedimento.
O VPA ex vivo protocolo de expansão também tem potencial para superar a perda significativa de linfócitos, que ocorre durante o gene edição11. Gene edição exige exposição a citocinas, que são necessárias para ciclismo células e ativação dos mecanismos de reparação do DNA. Devido aos efeitos de alerta do tratamento de VPA, esse método pode ser benéfico para a geração de um número maior de células geneticamente modificadas dentro de um período de tempo que é relevante para atualmente utilizados protocolos de modificação genética.
Neste documento, apresentamos um protocolo para rapidamente expandir significativamente o número de linfócitos humanos funcionais de UCBs. Os estudos cinéticos e piloto usando este protocolo indicam que o ex vivo expandidas células prontamente adquirir e manter a expressão de vários marcadores fenotípicos HSC incluindo CD90, bem como os primitivos HSC características metabólicas9.
Ex vivo protocolo de expansão é relativamente simples e confiável. Purificaç?…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NYSTEM conceder a C030136 de R.H. Gostaríamos de agradecer seu feedback e revisão do manuscrito Bartek Jablonski
Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
Inverted microscope | |||
PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |