Här beskriver vi ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller från CD34+ celler från navelsträngsblod behandlas med en kombination av en cytokin cocktail och VPA. Denna metod leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program.
Navelsträngen blod (UCB) enheter ger en alternativ källa av hematopoetiska stamceller (Förenta) för patienter som kräver allogen benmärgstransplantation. Även om UCB har flera unika fördelar, begränsar begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet deras användning i regenerativ medicin och HSC transplantation hos vuxna. Effektiv utbyggnad av funktionella mänsklig Förenta kan uppnås genom ex vivo odling av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med en histondeacetylas hämmare, valproinsyra (VPA). Protokollet beskrivs här beskriver odlingsbetingelser och metod att snabbt isolera CD34+ celler och expandera i hög grad en pool av primitiva Förenta. De utökade Förenta klarar av att upprätta både kortsiktiga och långsiktiga engraftment och kan ge upphov till alla typer av differentierade hematopoetiska celler. Denna metod har potential för klinisk tillämpning i autologa HSC genterapi och ger en attraktiv metod för att övervinna förlusten av funktionella Förenta associerade med gen editering.
Ex vivo expansion av hematopoetiska stamceller (Förenta) från navelsträngsblod (UCB) enheter innehar stort löfte för HSC applikationer inom regenerativ medicin och transplantation terapi. Transplantation med UCB enheter har flera unika fördelar som enkel samling, hög tillgänglighet, minimal risk för infektion, låg risk för återfall, och låg frekvens av transplantat-kontra-värd-sjuka (GVHD). De största nackdelarna av deras användning i kliniska inställningar är dock det begränsade antalet Förenta inom varje UCB enhet1. Ett otillräckligt antal Förenta resulterar i försenad engraftment och hematopoetisk återhämtning, risken för transplantatavstötning och avvikande immun beredning.
För närvarande har olika metoder och strategier utvecklats för att expandera det begränsade antalet Förenta från UCBs ex vivo. Kombinationer av olika cytokin cocktails med små molekyler eller föreningar i ex vivo kulturer resultera i olika grader av expansion i HSC nummer2,3,4,5,6, 7,8. Ännu viktigare, ex vivo kultur inducera villkor stress, vilket leder till snabb cellproliferation, ökad metabolisk aktivitet och förlust av de primitiva egenskaper som definierar primära Förenta. Därför behövs utveckla protokoll som leder till expansion av ett stort antal funktionella Förenta med egenskaper som liknar primära primitiva Förenta.
Serumfritt kulturer av CD34+ celler isolerade från UCBs och behandlas med valproic syra (VPA) resultat i utbyggnaden av stort antal primitiva Förenta4,9,10. HSC utbyggnaden är inte enbart på grund av spridningen av de befintliga Förenta härrör från UCBs. I stället beror denna expansion på förvärvet av en primitiv fenotyp kombinerat med ett begränsat antal celldelningar och spridning9. Inom de första 24-48 h inkubation med en kombination av cytokiner och VPA, CD34+ celler förvärva en transcriptomic och fenotypiska profil som kännetecknar långsiktiga Förenta. Den betydande ökningen i procentandelen av Förenta åtföljs av en snabb ökning av antalet Förenta (63 faldig ökning inom 24 h VPA behandling)9. Särskilt, expanderar VPA-ex vivo expansionsstrategin Förenta med låg metabolisk aktivitet, som ytterligare belyser deras primitiva kännetecken.
Den metod som beskrivs här ger tillstånd och behandlingar som leder till en betydande grad av ex vivo expansion av primitiva Förenta för antingen kliniska eller laboratorium program. Detta ex vivo expansionsstrategi använder en cytokin cocktail kombinerat med VPA behandling. VPA är en FDA godkända läkemedel för behandling av bipolär sjukdom och andra neurologiska sjukdomar. HSC expansion med VPA är snabb och sker inom 7 dagar, både tidpunkten för manipulation och risken för kontaminering minimeras. Allt möjliggör detta protokoll förvärv av långsiktiga HSC fenotypiska markörer såsom CD90 och CD49f inom 24-48 h efter behandling med VPA9. Utökad HSC ympkvistar skapas med detta protokoll har kapacitet att generera det hematopoetiska systemet eftersom de kan differentieras till alla hematopoetiska celler härstamningar och etablera långsiktiga engraftment efter transplantation i myeloablated NSG möss modeller4. Dessutom detta protokoll är mycket reproducerbara och möjliggör snabb och effektiv isolering av livskraftiga CD34+ celler från UCBs, som är avgörande för industrialisering av detta förfarande.
Frivilligt ex vivo expansion protokoll har också potential att övervinna den betydande förlust av Förenta som uppstår under gen redigering11. Gen redigering kräver exponering för cytokiner, som är nödvändiga för cykling celler och aktivering av DNA-reparationsmekanismer. På grund av de snabba effekterna av VPA behandling, kan denna metod vara fördelaktigt för generering av ett högre antal genetiskt modifierade celler inom en tidsperiod som är relevant för närvarande utnyttjas gen ändring protokoll.
Häri, presenterar vi ett protokoll för att snabbt utöka till en viktig grad antalet funktionella mänsklig Förenta från UCBs. Pilot och kinetiska studierna använder detta protokoll indikerar att den ex vivo expanderade celler snabbt förvärva och behålla uttrycket av flera HSC fenotypiska markörer inklusive CD90 samt primitiva HSC metabola egenskaper9.
Detta ex vivo expansion protokoll är relativt enkel och tillförlitlig. Rening av CD34+ celler med…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NYSTEM bevilja C030136 till R.H. Vi vill tacka Bartek Jablonski för hans feedback och granskning av manuskript
Expansion Media | Sigma-Aldrich | Stemline II stem cell expansion media S0192-500ML | |
AO/PI (acridine orange / propidium iodide) staining solution for live/dead Mammalian nucleated cells. | Nexcelom | CS2-0106-25mL | |
APC Mouse Anti-Human CD34 Clone 581 | BD BIOSCIENCE | 555824 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Clone MOPC-21 | BD BIOSCIENCE | 555751 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
BD Falcon 15 ml Tube | BD Biosciences | 352097 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352063 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
Bovine serum albumine solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CD34 MicroBead Kit, contain cd34 beads and fcr blocking reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-046-703 | |
Cell analyzer | BD Biosciences | FACS Canto II | |
Cell analyzer and sorter | BD Biosciences | FACS Aria II | |
Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto 2000 Cell Viability Counter | |
Cell separator device | autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec | ||
Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-PD100-002 | |
Density gradient media | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
Ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Clone 5E10 | BIOLEGEND | 328108 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | BIOLEGEND | 400109 | |
Inverted microscope | |||
PBS | Corning cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 308FKN | |
Recombinant Human IL-3 Protein (IL-3) | R&D Systems | 203-IL | |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC | |
Recombinant Human Thrombopoietin Protein (TPO) | R&D Systems | 288-TP | |
Total Antibody Compensation Bead Kit | thermofisher | A10497 | |
Umbilical Cord-blood | Placental Blood Program at the New York Blood Center | http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/ | |
Valproic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | P4543 |