ここでは、 elegans胚における高分解能顕微鏡、計算ツール、および単一細胞標識法を用いて、neurodevelopment 中の単一細胞動態を理解するための組合せアプローチを提示する。
Caenorhabditis elegans(C. elegans) は、生体内で単一細胞の分解能で、神経系全体の細胞起源を理解するという挑戦が観察できる唯一の有機体として際立っている。ここでは、 elegans胚に neurodevelopment を検査するための統合プロトコールを提示する。我々のプロトコルは、現像胚における単一細胞の画像化、lineaging および neuroanatomical トレースを組み合わせたものである。我々は、二重視野反転選択的平面照明顕微鏡 (diSPIM) の使用を通じて、ほぼ等方性空間分解能を有する生きたelegans胚の長期にわたる4次元 (4d) 画像化を達成する。線虫の胚における核とニューロンの構造は、すべての三次元で ~ 330 nm の分解能で画像を対しに融合して撮像される。次に、この分単位の高解像度4D データセットを分析して、単一細胞および細胞内レベルでの決定的な細胞系列の同一性と遺伝子発現および形態学的ダイナミクスを相関させます。私たちのプロトコルは、記述された各ステップのモジュラー実装を可能にし、胚発生、遺伝子発現、または neurodevelopment に関する研究を強化するように構成しています。
Elegansは、胚のすべての細胞が neurodevelopment を通して観察することができる唯一の生物として際立っている。細胞系列全体が既知で不変の1であり、胚の単一細胞の標識および連続画像化を可能にする新しいツールの開発とともに、生物学者は、線虫の神経の発達における異なるステップを検討することができるようになりましたすべての角度からのシステム-細胞誕生;移行と差別化;神経突起の形成、標的化した伸長および手筋;シナプス形成;機能回路のチューニング。Elegans胚におけるニューロン伸長ダイナミクスの捕捉は、レポーター及び蛍光顕微鏡を安定的に発現させることにより、科学界にとって貴重である。
C. elegansにおける発達研究は、しばしば、この種の不変の細胞系譜および細胞運命の地図を利用して、無傷の生物体1内の単一細胞レベルでの文脈的理解を増大させる。自動 lineaging 分析-StarryNite2、3、4 、AceTree5、6、7、8ソフトウェアを使用-高コントラスト、高解像度からの利点蛍光核の画像。最適に働くために、StarryNite/AceTree はまた開発の間にイメージされた胚の予測可能で限られたオリエンテーションによって決まる。共焦点顕微鏡は、2つのカバースリップ間で圧縮されたelegans胚において行われる、高コントラスト/高解像度および予測可能な拘束の両方を提供するので、10年以上にわたって標準のオート lineaging 顕微鏡法である胚の配向は7,8.我々は、以前、 C elegans胚形成などのライブサンプルイメージングのための新規ライトシートベースのデュアルビュー反転選択的平面照明顕微鏡 (diSPIM) の構築と使用について説明しました9,10,11,12,13. ライトシートの顕微鏡検査は、一般に、生きている3d 標本14,15の低い光毒性、高速および長期イメージ投射を提供する。DiSPIM 法は、具体的には、約 330 nm9のほぼ等方性の空間分解能を有する4次元 (4d) 画像を生成する。
共焦点顕微鏡検査と比較されて、diSPIM はより高い信号対雑音および速度を提供し、より等方性の空間分解能、および長期インビボのイメージ投射16のためにより適している。そこで diSPIM データを StarryNite/AceTree に適合させることに取り組み、lineaging 分析を強化するかどうかを検討した。主なハードルは、diSPIM 標本が卵殻圧縮によって容易に StarryNite/AceTree に期待される向きをとることができないことである。解析中のボリューム内のセル位置のランダムな方向は、自動 lineaging 解析の精度を低下させる。
従って私達は CytoSHOW を、ユーザーが diSPIM のイメージの前処理の間に胚の精密な3D オリエンテーションを選択することを可能にし、StarryNite に入力のための質の最大限に活用され、文脈に対応しているイメージデータを降伏させる視聴者ガイド付きユーザー・インタフェースを採用した/AceTree.画像化された胚のユーザ選択に際して、CytoSHOW は自動データ処理パイプラインを指揮する。トリミングされた、背景を減算した胚画像は、各位置、timepoint およびビューのための TIFF スタックファイル内に保存します。次に CytoSHOW は、そのプログラムを SpimFusion して、2つの前処理されたビューを共同登録し、共同 deconvolve して、等方性高解像度の体積画像を生成するためにリチャードソン-ルーシー17、18アルゴリズムを使用します。DiSPIM 固有のパラメータセットは、StarryNite が対し融合画像の画像セグメンテーションと核追跡の際にその動作を制御するために最適化されています。その後、融合イメージと lineaging 結果は AceTree を使用して編集されるため、ユーザーは StarryNite によって生成された自動系統トレース内のエラーを特定して修正することができます。AceTree はまた、胚の中の追跡された核の系譜木と3D モデルのレンダリングを提示することができます。スピムカメラの raw 画像と比較して、対しの融合画像を使用することで、lineaging の速度と精度が著しく向上することがわかります。私たちのプロトコルは、ここで説明するelegansアプリケーション用に最適化されている間、一般的に他の種または標本のために生産 diSPIM データの自動 lineaging に適応することができます。これがプロトコルの使用目的である場合は、3,4に記載されている新しい標本に対して、StarryNite パラメータの追加の調整が必要になる可能性があることに注意してください。
このプロトコルの実装を成功させることは、4D 等方性の分解能を持つ画像になり、生物学者が細胞系譜をトレースし、同時にelegans胚のニューロンを同定および分析することができる。さらに、いくつかの後処理アルゴリズムをマージすることにより、ハードウェアアクセラレーションがこれらの最も時間のかかるものであることから、生きている胚の細胞間の詳細とセルの系譜と細胞の運命の両方を本質的にリアルタイムで分析できるようになりました。この新しいプロトコルは、生体内の分化および形態形成の証拠研究中に、正確で情報に基づいた操作および細胞挙動の観察を可能にする。本稿では、胚発生、遺伝子発現または neurodevelopment の研究を強化するために、 elegans胚の開発における lineaging と細胞追跡のために開発したプロトコルの改良について詳細に説明する。
C. elegansは27の既知の各成体ニューロンの最終的な位置と接続性を持つ唯一の生物として際立っています。しかし、 elegansコネクトームを構成する作業回路やネットワークの組織化につながる発達力学は不明のままである。光顕微鏡の進歩から生じた機会に基づいて、 elegans胚発生における細胞の位置、形態形成、および神経新生を捕捉し、分析することができるようになりました。
我々が研究室で日常的に使用している手順は、 C elegans胚の細胞 lineaging に対する標識ニューロンと核の 4d-等方性画像をもたらす。さらに重要なことは、diSPIM を使用した長期的なイメージング条件を最適化し、半自動 lineaging 機能と高解像度画像を組み合わせて、 C elegansの胚発生を解析する速度と精度を向上させることです。この統合されたプロトコルにより、ユーザーは初期のけいれんの開始を通じて、細胞を可視化して識別し、神経突起の移行や軸索手筋などの三次元特徴を定量化することができます。この手順は、ASI diSPIM システムと任意の施設に容易に適合することができ、我々はこのプロトコルのために特別にこのシステムをお勧めします。商業的に提供される他のスピム製剤は、試料チャンバーおよび光学的特性における ASI 構成とは異なる場合がある。ただし、他のプラットフォームからエクスポートされたデータは、データパイプラインを介して配置することもできます。したがって、lineaging におけるそれらの値の評価は、画像品質および器具安定性の厳しい試験であり、実現可能である。我々は積極的に他の標本 (ショウジョウバエおよびゼブラフィッシュ胚など) をイメージするために diSPIM を使用しているが、胚の記述および包括的な lineaging 分析は、現在でも線虫種に限定されている。より大きいか厚いサンプルのために、私達は静止した軽いシートを通してサンプルをスキャンする段階スキャンのアプローチを使用することを選ぶ。クマール et al. 以前は、diSPIM10に追加の変更を加えることなく厚いサンプルから高品質の画像を生成するために、この改良された diSPIM 断面を実証しました。
プロトコル内の重要なステップは、カバースリップコーティングされたポリ L リジンへのelegans胚の取り付け、データ取得、およびデータ処理を含む。ガラスカバースリップに収穫し、 elegansの胚を取付けることは経験の浅いユーザーに挑戦することができるが、ここで学習を促進するために主要なステップの詳しい議定書を提供する。長期画像化が望まれる場合、我々は8-10 若年成人28から4細胞またはそれ以前の胚を収穫する最良の結果を得る。高齢者は、子宮の古い胚と未受精卵を含む傾向があるので、初期の胚を収穫することはあまり望ましくないことに注意してください。取り付け胚に関しては、組み立てられた吸引器 (口ピペット) の閉塞や microcapillary ピペットでの開口の大きすぎるなどの問題が、胚の適切な取り付けおよび配向を妨げることがある。最適なイメージングのために準備するために、我々は、光シート、カメラ、目標、およびオートフォーカスの性能をチェックするために、早期および後期事前けいれん胚の事前捕捉試験を行います。これらのすべての操作がテストされ、プリ集録テスト中に高品質の画像が得られると、最良の結果を得ることができます。これは、両ビュー (目標) から取得した raw 画像が高品質でなければならない等方性空間分解能を持つ画像を生成する場合に特に重要です。取得後、各ビューについて取得したボリュームは、等方性画像を生成するために処理されます。このプロトコルで説明されているように、適切なグラフィックスプロセッシングユニット (GPU) カードを使用することが重要です (下記参照)。これにより、対しの融合画像が生成される処理速度が向上し、データ解析までの時間を短縮することができます。また、ユーザーが CytoSHOW の最新バージョンを実行しており、StarryNite 自動 lineaging のダウンロードバンドルで提供されているパラメーターを使用していることも不可欠です。他のサンプル (例えば、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエなど) の自動 lineaging を使用することに興味がある場合は、StarryNite で使用されるパラメータに追加の最適化が必要になります (参照3,4を参照)。
私たちの統合されたプロトコルは、画像と lineaging の結果を事前にけいれん胚に提供しますが、ユーザーは、lineaging 後の胚における自動的な変化は現在実現不可能であることに注意すべきである: 核の位置は、秒の順序で過剰にけいれんした胚は、系統追跡を可能にするには速すぎる。しかし、diSPIM は、神経発達のイベントを捕捉し、23,29の胚発生後の段階でいくつかの細胞位置を追跡する有望な能力を実際に実証した。ユーザーがけいれん後の胚を調べることに興味がある場合、diSPIM は容積型のスナップショットを得る速度を提供し、急速に移動する胚における神経突起伸長などの微細な神経発達イベントを追跡します。
このプロトコルは、WormGUIDES アトラス30の細胞ごとの完了のための基礎となり、高解像度等方性画像を有する統合アプローチを提供し、 中に標識されたニューロンの3d 形態を識別し、捕捉する。胚発生の最初の430分。それがあるように、プロトタイプ WormGUIDES アトラスは、開発胚の細胞の核位置を提供し、胚ニューロンのサブセットの発達ダイナミクスを捕捉することを目的としています。このプロトコルは、追加の開発ニューロンを WormGUIDES アトラス30に統合するための鍵となります。
私たちの統合されたプロトコルはまた、 elegans胚における新しい遺伝子発現プロファイルの探索を容易にします。トランスジェニックc. elegansにおいて、多くの細胞特異的プロモーターは、トランスジーン発現を空間的に時間的に制御する。ほとんどの遺伝子の発現パターンは成人動物31、32、33、34で広範囲に特徴付けられているが、ほとんどすべてが開発において特徴付けられることはまだない (特に後期) 胚。Elegans promoterome は、ワームコミュニティにとって細胞特異的なトランスジーン発現を促進し、遺伝子機能が細胞自律的であるか非自律的であるかを判断するために役立つリソースとなっています。等方性高解像度と動的発現パターンの遺伝子を捕捉し、lineaging を介して発現細胞を正確に同定することは、科学界の多くの人にとって貴重なものとなるであろう。
胚発生は、主要なプロセス、細胞分化および組織形態形成の2つの絡み合いを含む。Elegansの開発中に異なる細胞型を定義するメカニズムと分子については、多くのことが知られています。しかし、 elegans胚における細胞遊走、細胞接着、細胞形状にとって重要なメカニズムについては、ほとんど分かっていない。Elegans不変の細胞系統が知られているので、我々のプロトコルは、新しい詳細レベルでの形態形成の間に、例えば軸索手筋、シナプス形成、ニューロン活動といった、カタログ化された microanatomy の胚を容易に識別することを可能にする。Ardiel et al. は以前、 C elegans胚における単一ニューロンのレベルでのカルシウムトランジェントを捕捉するために diSPIM の力を実証した。発達生理学の他の多くの側面は、これらの方法による問い合わせのために熟している。
最後に、このプロトコルは主に自動化されており、逆畳み込み画像を生成し、StarryNite および Acetree を介してセル lineaging を実行するのにかかる時間を体系的に削減します。このプロトコルで使用されるソフトウェア戦略は、我々はここでそれらを実証している非常に特定の分野から遠く離れた生物学の多くの質問に適用することができます。
ソフトウェアの互換性とダウンロードアクセスの詳細
マイクロマネージャーと diSPIM イメージングのプラグインに関する情報は、http://dispim.org/software/micro-manager と https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin で入手できます。
現在、データ処理パイプラインには Windows オペレーティングシステムが必要です。私たちは、すべての必要なデータ処理プログラムとサポートファイルのインストールを簡素化するために、単一のアーカイブファイルをバンドルしています。Http://dispimlineage.wormguides.org でダウンロードできます。
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) は、広く使用されているオープンソース画像解析プラットフォーム、ImageJ (v1) に基づいています。CytoSHOW を使用するには java をコンピュータにインストールして最新の状態にする必要があり、CytoSHOW の更新は Java Web Start を介して自動的に展開されます。CytoSHOW の多くの ImageJ ベースの機能は、https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html で説明されており、図示している。CytoSHOW は、ASI diSPIM からの多次元の生データ、および TIFF 出力を作成するその他のイメージングソフトウェアを表示するようにカスタマイズされています。原理的には、他のマルチビュースピムイメージングシステムは、このプロトコルは、異なる顕微鏡システム上で実行することを可能にするために CytoSHOW のマイナーな変更によってサポートすることができます。
SpimFusion は、Visual Studio 2013 を使用した cuda/C++ で CUDA toolkit v 7.5 で書かれました。SpimFusion を実行するには、特定のコンピュータハードウェアが必要です: CUDA 計算機能1.0 以上と最小 2 GB のグラフィックスカードメモリを備えた NVIDIA グラフィックスプロセッシングユニット (GPU) カード。私たちのプロトコルの公開時には、SpimFusion は未発表 (最小の Shroff とハリのない) ですが、上記のソフトウェア・バンドル・アーカイブで利用可能です。
特別に構築されたコマンドライン駆動バージョンの StarryNite では、自由に利用できる MATLAB コンパイラランタイムがインストールされている必要がありますが、商用 MATLAB ソフトウェアのライセンスは必要ありません。MATLAB コンパイラーのランタイムは、前述のソフトウェア・バンドル・アーカイブに含まれています。このプロトコルで使用される StarryNite のコードは、共焦点画像6に使用されるものと本質的に変わりません。しかし、StarryNite 処理のための入力画像の作成および StarryNite 結果の処理のためのいくつかの運用上の問題は、溶融等方性のための連続データ処理パイプラインを可能にする CytoSHOW の方法によってここで対処されている diSPIMボリューム。これらの変更は、これらの前処理および後処理のステップを処理する CytoSHOW コードによって自動化されています。CytoSHOW はまた、事前に最適化された diSPIM 固有のテンプレート StarryNite パラメータセットを編集して、セグメンテーションアルゴリズムを画像データ内の原子核の蛍光強度に自動的に調整します。その後、各 diSPIM データ・セットで StarryNite によって使用される固有のパラメーターが、出力イメージおよび lineaging データとともにファイルに保存されます。
16ビットイメージで動作し、Java3D レンダリングとの互換性を維持する AceTree のカスタムバージョンは、このプロトコルに最も適しています。また、前述のソフトウェア・バンドル・アーカイブにも含まれています。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、lineaging 株 BV514 を生成するために、統合株、ujIs113 のジョンマレーに感謝します。ブランドン・ハーベイ (NIBIB) プロトコルのテストについてのヘルプ。ジョン・ダニエルズとゲイリー・ロンドー (応用科学機器) マイクロマネージャーと diSPIM 楽器の支援のため;そして、アンドリュー・ヨークとハンク・エデンは、diSPIM システムに関する重要なフィードバックのために。また、会議とブレーンストーミングのプラットフォームを提供するためのセルバンテス文化センター・デ・ Neurobiología ホセ・デル・カスティージョ (ユニベルシダード・デ・プエルトリコ) の研究センターにも感謝しています。この作品の多くは、森の穴にある海洋生物学研究所でホイットマンプログラムを通して行われました。この作品は、NIH 国立生物医学イメージング研究所とバイオエンジニアリングの学内研究プログラム、および NIH 助成金によってサポートされていました。U01-HD075602 とノーR24-OD016474。マーク w. モイルは、F32 ・ NS098616 によってサポートされ、R24-OD016474 の多様性の補足によってサポートされました。
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |