Genotypering van zeeanemonen tijdens de vroege ontwikkeling
Summary
Het doel van dit protocol is het genotype van de zeeanemonen Nematostella vectensis tijdens de gastrulatie zonder het embryo op te offeren.
Abstract
Hier beschreven is een PCR-gebaseerd protocol voor genotype de gastrulastadium fase embryo van de zacht cnidarian nematostella vectensis zonder de levensduur van het dier in te boeten. Na in-vitro fertilisatie en de-jellying mogen zygoten gedurende 24 uur bij kamertemperatuur worden ontwikkeld om de vroege-tot mid-gastrula-fase te bereiken. De gastrulastadium-embryo’s worden vervolgens op een agarose-gelbed geplaatst in een Petri schaaltje met zeewater. Onder de ontleed Microscoop wordt een Wolfram naald gebruikt om een de weefsel fragment van elk embryo chirurgisch te scheiden. Na de operatie mogen embryo’s genezen en verder ontwikkelen. Genomisch DNA wordt geëxtraheerd uit het geïsoleerde weefsel fragment en gebruikt als een sjabloon voor Locus-specifieke PCR. Het genotype kan worden bepaald op basis van de grootte van PCR-producten of de aanwezigheid/afwezigheid van allel-specifieke PCR-producten. Na de operatie worden embryo’s gesorteerd volgens het genotype. De duur van het gehele genoom proces hangt af van het aantal te screenen embryo’s, maar het minimaal vereist 4 – 5 uur. Deze methode kan worden gebruikt om Knockout mutanten te identificeren uit een genetisch heterogene populatie embryo’s en maakt analyses van fenotypes mogelijk tijdens de ontwikkeling.
Introduction
Cnidarianen vertegenwoordigen een gevarieerde groep dieren, waaronder kwallen, koralen en zeeanemonen. Ze zijn diploblasten, samengesteld uit Ectoderm en endoderm die worden gescheiden door een extracellulaire matrix (mesoglea). Cnidaria is een zustergroep van de speciose bilateria, die traditionele diermodellen zoals Drosophila en Mus Belong1. Bovendien, de Cnidaria-bilateria divergentie is gedacht te hebben plaatsgevonden in de pre-Cambrium periode2. Als zodanig zijn vergelijkende studies van cnidarianen en bilaterialen essentieel voor het verkrijgen van inzicht in de biologie van hun meest recente gemeenschappelijke voorouder. Recentelijk heeft vergelijkende genomics onthuld dat cnidarianen en bilaterialen veel ontwikkelingtoolkit genen zoals inkepingen en bhlh delen, wat impliceert dat hun gemeenschappelijke voorouder al deze genen3had. Echter, de rol van deze ontwikkelings Toolkit genen in de laatste gemeenschappelijke voorouder van Cnidaria en bilateria is relatief minder goed begrepen. Om dit probleem aan te pakken, is het van cruciaal belang om te bestuderen hoe deze diep geconcregeerde genen in cnidarianen functioneren.
Een van de opkomende cnidarische genetische modellen is de zacht nematostella vectensis. Het genoom is gesequentieerd3, en een verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen, waaronder morfolino-gemedieerde Gene knockdown, meganuclease-gemedieerde Transgenese, en Crispr Cas9-gemedieerde genen knockins en Knockouts, zijn nu beschikbaar voor gebruik in dit dier. Daarnaast is de ontwikkeling van Nematostella relatief goed begrepen. Tijdens de embryo genese treedt de gastrulatie op door invaginatie4, en het embryo ontwikkelt zich tot een vrij-zwemmend planula larve. De planula transformeert vervolgens in een Sessile poliep met een mond en circumoreel tentakels. De poliep groeit en bereikt seksuele volwassenheid.
Crispr Cas9-gemedieerde gerichte mutagenese wordt nu routinematig gebruikt om de genfunctie in nematostella vectensis5,6,7,8,9te bestuderen. Om Knockout mutanten in Nematostellate genereren, wordt eerst een cocktail met Locus-specifieke enkelvoudige rna’s en het endonuclease Cas9-eiwit in onbevruchte of bevruchte eieren geïnjecteerd om F0-oprichter dieren te produceren die doorgaans mosaicisme. F0 dieren worden vervolgens tot seksuele volwassenheid verheven en met elkaar gekruist om een F1-populatie te produceren, waarvan een subset van de mutanten6kan zijn. Als alternatief kunnen seksueel volwassen F0 dieren worden gekruist met wild type dieren om F1 heterozygoot dieren te genereren, en F1-heterozygoten die een knock-outallel dragen in de Locus van belang kunnen vervolgens met elkaar worden doorkruist om F2-nakomelingen te produceren, een kwart waarvan wordt verwacht dat ze Knockout mutanten5. Beide benaderingen vereisen een methode om knock-outmutanten van een genetisch heterogene populatie te identificeren. Polyp tentakels kunnen worden gebruikt voor het uitpakken van genomisch DNA voor genotype6,7. Echter, in gevallen waarin de ontwikkelings functie van het gen van belang wordt onderzocht en Mutant embryo’s de poliep fase niet bereiken (d.w.z. vanwege de larvale letaliteit die gepaard gaat met de mutatie), moeten knock-outmutanten vroegtijdig in ontogenie worden geïdentificeerd. Hier beschreven is een PCR-gebaseerd protocol voor genotype-individuele dieren in het gastrulastadium-stadium zonder het dier op te offeren, waardoor de identificatie van uitfaserende mutanten uit een genetisch heterogene populatie embryo’s mogelijk is. De duur van het gehele genoom proces hangt af van het aantal te screenen embryo’s, maar het minimaal vereist 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven een PCR-gebaseerd protocol voor genotype een enkele zeeanemonen embryo zonder het dier op te offeren. Na het paaien en de-jellying mogen de bevruchte eitjes zich ontwikkelen tot gastrulae. Het de-gebied van elk gastrulastadium-embryo wordt chirurgisch verwijderd en het geïsoleerde de-weefsel wordt gebruikt voor daaropvolgende genomische DNA-extractie, terwijl de overgebleven embryo’s na de operatie genezen en doorgaan met de ontwikkeling. De gDNA-extracten worden vervolgens gebruikt voor een PCR-test om …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken anonieme reviewers voor opmerkingen over de eerdere versie van het manuscript, waardoor het manuscript is verbeterd. Dit werk werd gesteund door fondsen van de Universiteit van Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Biologie du développement. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Biologie du développement. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Biologie du développement. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
