Genotyperingteknologi av Sea Anemone under tidlig utvikling
Summary
Målet med denne protokollen er å genotype havet Anemone Nematostella vectensis under gastrulation uten å ofre det embryo.
Abstract
Beskrevet her er en PCR-basert protokoll for å genotype den gastrula scenen embryo av anthozoan Nesledyr Nematostella vectensis uten å ofre livet til dyret. Etter in vitro befruktning og de-jellying, zygotes har lov til å utvikle for 24 timer ved romtemperatur for å nå tidlig til midten av gastrula scenen. Den gastrula embryo blir deretter plassert på en agarose gel seng i en Petri parabolen inneholder sjøvann. Under dissekere mikroskop brukes en tungsten nål til å kirurgisk skille en aboral vev fragment fra hvert embryo. Post-kirurgi embryo er da lov til å helbrede og fortsette utviklingen. Genomisk DNA trekkes ut fra det isolerte vevs fragmentet og brukes som mal for geometrisk spesifikk PCR. Genotype kan fastslås basert på størrelsen på PCR-produkter eller tilstedeværelse/fravær av allel-spesifikke PCR-produkter. Etter operasjonen embryo sorteres deretter i henhold til genotype. Varigheten av hele genotyperingteknologi prosessen avhenger av antall embryo som skal undersøkes, men det krever minimalt 4 – 5 timer. Denne metoden kan brukes til å identifisere knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning på embryo og muliggjør analyser av fenotyper under utvikling.
Introduction
Trichoplax representerer en mangfoldig gruppe av dyr som inkluderer maneter, koraller, og sjø anemoner. De er diploblasts, bestående av ektoderm og endoderm som er adskilt av en ekstracellulære matrise (mesoglea). Cnidaria er en søster gruppe til speciose Bilateria, som tradisjonelle dyremodeller som Drosophila og mus hører til1. I tillegg antas det at Cnidaria-Bilateria-forskjellene har forekommet i pre-Cambrian periode2. Som sådan, komparative studier av Trichoplax og bilaterians er avgjørende for å få innsikt i biologi av deres siste felles stamfar. Nylig har komparative Genomics avdekket at Trichoplax og bilaterians dele mange utviklingsmessige Toolkit gener som hakk og bHLH, noe som tyder på at deres felles stamfar allerede hadde disse genene3. Imidlertid er rollen til disse utviklingsmessige verktøykasse gener i den siste felles stamfar til Cnidaria og Bilateria sammenlignbare mindre godt forstått. For å løse dette problemet er det avgjørende å studere hvordan disse dypt bevarte genene fungerer i Trichoplax.
En av de nye Nesledyr genetiske modellene er anthozoan Nematostella vectensis. Dens Genova er blitt i rekkefølge3, og en variasjon av genetisk verktøy, inkluderer morpholino-mediert gen knockdown, meganuclease-mediert transgenesis, og CRISPR-Cas9-mediert gen knockins og Knockouts, er nå anvendelig for bruk i denne dyr. I tillegg er Nematostella utvikling relativt godt forstått. Under embryogenesis skjer gastrulation ved invagination4, og fosteret utvikler seg til et fritt-svømming planula Larven. Planula senere forvandles til en fastsittende polypp med en munn og circumoral tentakler. Den polypp deretter vokser og når seksuell modenhet.
CRISPR-Cas9-mediert målrettet mutagenese er nå rutinemessig brukt til å studere gen funksjon i Nematostella vectensis5,6,7,8,9. For å generere knockout mutanter i Nematostella, en cocktail som inneholder geometrisk-spesifikke single-guide RNAs og endonuclease Cas9 protein er først injiseres i ubefruktede eller befruktet egg til å produsere F0 grunnlegger dyr som vanligvis viser mosaikk. F0 dyr er senere hevet til seksuell modenhet og krysset med hverandre for å produsere en F1 befolkning, en undergruppe som kan være knockout mutanter6. Alternativt kan seksuelt modne F0 dyr krysses med vill-type dyr for å generere F1 heterozygot dyr, og F1 heterozygotes som bærer en knockout allel i det geometriske interesse kan deretter krysses med hverandre for å produsere F2 avkom, en fjerdedel som forventes å være knockout mutanter5. Begge tilnærminger krever en metode for å identifisere knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning. Polypp tentakler kan brukes til å trekke ut genomisk DNA for genotyperingteknologi6,7. Men i tilfeller der utviklingsmessige funksjon av genet av interesse blir undersøkt og mutant embryo ikke når polypp Stadium (dvs. på grunn av larvestadiet dødelighet forbundet med mutasjon), knockout mutanter må identifiseres tidlig i Ontogenese. Beskrevet her er en PCR-basert protokoll for å genotype individuelle dyr på gastrula scenen uten å ofre dyret, noe som muliggjør identifisering av knockout mutanter fra en genetisk heterogen befolkning på embryo. Varigheten av hele genotyperingteknologi prosessen avhenger av antall embryo som skal undersøkes, men det krever minimalt 4-5 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her en PCR-basert protokoll for å genotype en enkelt sjø Anemone embryo uten å ofre dyret. Etter gyting og de-jellying, befruktet egg har lov til å utvikle seg til gastrulae. Den aboral regionen av hver gastrula embryo er kirurgisk fjernet, og den isolerte aboral vevet brukes til påfølgende genomisk DNA-ekstraksjon, mens de resterende post-kirurgi embryo helbrede og fortsette utviklingen. GDNA-ekstrakter brukes deretter for en PCR-analyse for å fastslå genotype til hvert embryo. Denne metoden utnytter m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker anonyme anmeldere for kommentarer til den tidligere versjonen av manuskriptet, som forbedret manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Universitetet i Arkansas.
Materials
| Drosophila Peltier Refrigerated Incubator | Shellab | SRI6PF | Used for spawning induction |
| Instant ocean sea salt | Instant ocean | 138510 | |
| Brine shrimp cysts | Aquatic Eco-Systems, Inc. | BS90 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Standard Orbital Shaker, Model 3500 | VWR | 89032-092 | |
| TRIS-HCl, 1M, pH8.0 | QUALITY BIOLOGICAL | 351-007-01 | |
| Potassium chloride | VWR | BDH9258 | |
| EDTA, 0.5M pH8 | VWR | BDH7830-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Nonidet-P40 Substitute | US Biological | N3500 | |
| Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
| Agarose | VWR | 710 | |
| Micro Dissecting needle holder | Roboz | RS-6060 | |
| Tungsten dissecting needle | Roboz | RS-6063 | |
| PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers | Eppendorf | E6336000024 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England BioLabs | M0530L | |
| dNTP mix | New England BioLabs | N0447L | |
| GLWamide universal forward primer | 5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-a | 5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’ | ||
| Reverse primer specific to glw-c | 5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’ |
References
- Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).
- Erwin, D. H., et al. The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals. Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).
- Putnam, N. H., et al. Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization. Science. 317 (5834), 86-94 (2007).
- Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression. Biologie du développement. 305 (2), 483-497 (2007).
- Nakanishi, N., Martindale, M. Q. CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone. eLife. 7, e39742 (2018).
- He, S. N., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377 (2018).
- Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis. Nature Communications. 5, 5486 (2014).
- Servetnick, M. D., et al. Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning. Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).
- Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer. Nature Communications. 7, 11694 (2016).
- Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis. Biologie du développement. 310 (2), 264-279 (2007).
- Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled. Biologie du développement. 310 (1), 169-186 (2007).
- Shinzato, C., et al. Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change. Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).
- Gold, D. A., et al. The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity. Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).
- Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).
- Momose, T., et al. High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion. Scientific Reports. 8, 11734 (2018).
- Artigas, G. Q., et al. A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia. eLife. 7, e29555 (2018).
